L-디프레닐의 신경보호 작용과 대사체의 거울상이성질체 분석

Abstract

파킨슨씨병 (Parkinson s disease)에서 도파민 신경의 선택적인 퇴화의 원인은 아직 정확히 밝혀져 있지 않지만 최근 가장 많이 거론되고 있는 것은 산화적 스트레스에 의한 신경퇴행이다. Monoamine oxidase B (MAO-B) 저해제인 l-디프레닐 (l-deprenyl)은 단독 또는 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-dopa)과 병용하여 파킨슨씨병 치료제로 사용되고 있는 약물로서 주된 작용인 MAO-B 저해작용 이외에 항산화 작용, antiapoptosis 작용 등에 의하여 신경보호 작용을 나타낸다고 알려져 있으나 이 약물의 신경보호 효과에 대한 정확한 기전에 대하여는 아직 밝혀져 있지 않다. 본 연구에서는 l-디프레닐의 신경보호 작용을 조사하기 위하여 먼저 정상 흰쥐 및 6-하이드록시도파민 (6-OHDA)으로 뇌내 도파민 (dopamine) 고갈을 유도한 병변쥐에서 도파민, 세로토닌 (5-hydroxytryptamine; 5-HT)및 이들 대사체의 함량을 측정하였고, l-디프레닐을 전처리 한 흰쥐에서도 뇌내 아민류의 함량 변화를 조사하였다. l-디프레닐의 항산화 작용은 human neuroblastoma SH-SY5Y 세포를 사용하여 l-디프레닐이 6-OHDA에 의한 세포 사망과 활성산소종 (reactive oxygen species; ROS) 생성에 미치는 영향을 조사하여 검토하였다. 또한 l-디프레닐의 antiapoptosis 작용이 caspase 활성 억제와 직접적인 관련이 있는가를 알아보기 위하여 anti-poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) 항체를 이용하여 caspase 활성을 측정하였다. 실험 결과 정상쥐에서 0.25 및 1 mg/kg의 l-디프레닐을 1회 투여시 선조체내 도파민 및 5-HT 대사에 영향을 미치지 않았으나 10 mg/kg 투여군에서는 도파민의 대사가 저해되었고, 0.25 및 1 mg/kg 용량을 3주간 반복투여시에는 선조체내 도파민 대사체인 3,4-dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC) 및 homovanilic acid (HVA)가 감소됨으로써 도파민 대사가 용량의존적으로 저해되는 것을 관찰하였다. 6-OHDA (200 μg)을 양측 뇌실에 투여하고 선조체, 중격, 해마, 시상하부 및 뇌간의 뇌 조직에서 도파민, 5-HT 및 이들 대사체 함량을 측정하였을 때 선조체와 중격에서 각각 81%와 90%의 도파민 고갈이 유도되었으며, 해마에서 5-HT이 70% 고갈되었다. 그러나 l-디프레닐을 전처치하였을 때 선조체와 중격에서 도파민의 함량은 l-디프레닐을 처치하지 않은 6-OHDA 병변쥐에 비해 3배 정도 되었으며, 도파민 대사체들도 전처리군에서 선조체와 중격에서 모두 함량이 많았다. MAO-B 활성이 결여되어 있다고 보고되어 있는 SH-SY5Y 세포에 10 ∼ 200 μM의 6-OHDA을 24시간 처리하였을 때 세포생존률은 유의적으로 감소되었고, 세포내 ROS의 발생도 농도의존적으로 증가되어 6-OHDA에 의하여 산화적 세포손상이 유도되었음을 알 수 있었다. 이러한 산화적 세포손상은 l-디프레닐에 의하여 회복되었는데, 0.01 nM ∼ 1 mM의 l-디프레닐을 30분간 전처치하였을 때 6-OHDA에 의한 세포 사망이 유의적으로 억제되었으며, 이러한 억제효과는 l-디프레닐 10 μM에서 가장 크게 나타났다. 6-OHDA에 의한 세포내 ROS 발생 역시 10 μM의 l-디프레닐의 전처치 (37℃, 30 min)에 의하여 유의적으로 감소되어 ROS 발생은 50 μM의 6-OHDA 단독 처리군에 비하여 48% 감소되었다. 한편 SH-SY5Y 세포에 25 및 50 μM의 6-OHDA을 12시간 처리하였을 때 PARP의 분해 생성물 (85 kD)이 관찰되어 6-OHDA에 인하여 caspase-3 활성이 증가되었음을 간접적으로 확인하였다. 그러나 l-디프레닐을 6-OHDA과 동시에 처리하였을 때 PARP 분해에 아무런 변화가 관찰되지 않아 l-디프레닐은 6-OHDA에 의한 caspase 활성 증가에는 억제 효과를 나타내지 않는 것으로 나타났다. 이상의 결과로부터 l-디프레닐은 전처치에 의하여 6-OHDA에 의한 병변쥐에서 뇌 조직내 도파민 및 대사체의 고갈이 억제되었으며, SH-SY5Y 세포내에서 6-OHDA에 의한 세포 사망과 ROS 생성이 감소되었음을 관찰하였다. 6-OHDA의 신경독성 기전은 효소촉매작용 (MAO-catalyzed process)과는 무관한 자동산화에 의한 산소 유리기 (free radical) 생성에 의한다고 보여지며 MAO-B 활성이 없다고 보고된 신경 세포에서의 상기 결과로부터 본 연구에서 관찰된 l-디프레닐의 도파민 및 대사체 들의 함량 증가와 도파민 turnover 억제 작용 및 6-OHDA에 의한 세포독성에 대한 l-디프레닐의 보호 작용은 단순한 MAO-B 저해 작용 이외에도 직접적인 ROS 생성 억제 작용 등 항산화 작용에 의한 것으로 사료된다. 한편 본 연구에서 l-디프레닐은 caspase 활성에 아무런 영향을 미치지 못하였으므로 l-디프레닐의 antiapoptosis 작용은 caspase 활성 억제이외의 다른 기전에 의할 것으로 추정되나 이에 대하여는 앞으로 더욱 연구가 필요할 것이다. 한편 l-디프레닐은 체내에서 l-메스암페타민 (l-MA) 및 l-암페타민 (l-AM)으로 대사되므로 생체시료에서 검출되는 MA이 치료 목적에 의한 l-디프레닐 복용에 의한 것인지 아니면 불법 약물 (d-MA) 복용에 의한 것인지를 판별하는 시험법을 확립하고자 흰쥐와 건강한 사람에게 l-디프레닐을 투여한 후 요중 대사체를 분석하여 MA 투여군과 비교하였다. l-디프레닐 및 MA의 대사체 분석은 chiral selector로서 carboxy methylated β-cyclodextrin (CMCD)을 사용한 모세관 전기영동법 (capillary electrophoresis; CE)에 의하여 시행하였으며, 본 방법에서 이들 대사체는 l-체 및 d-체가 서로 뚜렷하게 분리되어 대사체 분석에 의한 l-디프레닐 복용과 MA 복용의 구분이 가능하였다. 흰쥐에 10 mg/kg의 l-디프레닐을 투여한 후 24시간 동안 채취한 요에서 대사체인 l-AM, l-MA, l-desmethylselegiline (l-DMS) 및 미변화된 l-디프레닐이 검출되었으며, l-AM/l-MA 비율은 평균 2.45±0.55였다. 흰쥐에 5 mg/kg의 d-MA를 투여하였을 때 요중 d-AM/d-MA 비율은 평균 0.98±0.25였고, 10 mg/kg의 dl-MA을 투여한 경우d-AM/d-MA 및 l-AM/l-MA 비율은 각각 0.72±0.24 및 0.71±0.21이었다. 사람의 경우 10 mg의 l-디프레닐을 복용하고 24시간 채취한 요에서 l-MA, l-AM 및 l-DMS가 검출되었고, l-AM/l-MA 비율은 평균 0.33±0.03으로서 d-MA 남용자의 d-AM/d-MA 비율인 0.20±0.12보다 유의적으로 높게 나타났다. 이와 같이 l-디프레닐 및 MA의 대사 패턴과 대사체의 배설량 (% of dose)은 사람과 쥐에서 종간의 차이를 보였으나, AM/MA 비율은 동물 및 사람에서 모두 l-디프레닐 투여군이 MA 투여군보다 더 높게 나타나는 특징을 보였다. 따라서 본 연구에서 사용한 CE에 의한 거울상이성질체 분석에 의하여 l-디프레닐 및 MA과 이들의 대사체 들을 동시에 분리할 수 있었으며, 또한 짧은 시간내에 분석이 가능하였고, 본 방법에 의하여 치료목적으로서의 약물 복용과 불법 약물 복용을 판단할 수 있는 근거를 제시할 수 있었다. 또한 l-디프레닐 및 MA의 요에서의 AM/MA 비율은 키랄화합물 분석기기가 마련되지 못한 환경에서 l-디프레닐 및 MA 복용을 구분할 수 있는 간접적인 판단 자료의 하나로 이용될 수 있어 법과학 분야에서 매우 유용할 것이다. ; A neurotoxin, 6-hydroxydopamine (6-OHDA), has long been used in research to selectively lesion the catecholaminergic pathways, particularly the nigrostriatal dopamine (DA) pathway, as a Parkinson s disease model. Enhanced oxidative stress has been suggested to be involved in the degeneration of nigrostriatal dopaminergic neurons in Parkinson s disease. Whereas a selective inhibitor of monoamine oxidase type B, l-deprenyl (R(-)-N-methyl-N-(1-phenyl-2-propyl)-2-propargylamine; selegiline), is now widely used in the treatment of Parkinson s disease, the precise action mechanism of the drug remains elusive. Several reports have suggested that l-deprenyl might exert antioxidant effects and protect neurons, via mechanisms that are independent of MAO-B inhibition. The first set of experiments in this study was designed to investigate protective effect of l-deprenyl against the dopamine depletion induced by 6-OHDA. The changes in tissue contents of dopamine, serotonin (5-HT) and their metabolites by l-deprenyl were examined in intact and 6-OHDA-lesioned rat brain. In intact rats, a single intraperitoneal (i.p.) administration of l-deprenyl showed no changes in striatal dopamine and its metabolites at low concentrations (0.25 and 1 mg/kg), but significantly inhibited dopamine metabolism at a higher concentration (10 mg/kg). The repeated administration of l-deprenyl (0.25 and 1 mg/kg, i.p., for 21 consecutive days) reduced the contents of 3,4-dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC) and homovanilic acid (HVA) in dose-dependent manners without changes in dopamine content. Bilateral intracerebroventricular (i.c.v.) infusion of 6-OHDA (100 μg/10 μL/hemisphere) depleted dopamine in striatum and septum by 81% and 90%, respectively, and decreased 5-HT levels by 70% in hippocampus. When rats were pretreated with l-deprenyl before 6-OHDA administration, the striatal and septal dopamine levels were significantly increased by about 3.0-fold and 3.4-fold, respectively, compared to the untreated 6-OHDA-lesioned rat. Pretreatment of l-deprenyl also significantly enhanced the dopmaine metabolites, DOPAC, HVA and 3-methoxytyramine (3-MT), in the striatum, and DOPAC in the septum. These results indicate that a l-deprenyl pretreatment prevents 6-OHDA-induced depletion of striatal dopamine and its metabolites. Next, the protective effects of l-deprenyl against 6-OHDA-induced neurotoxicity and oxidative stress were examined in catecholaminergic neuroblastoma SH-SY5Y cells that are known to lack MAO-B activity. The neuronal toxicity was evaluated by assessment of cell viability using the MTT assay, and the oxidative stress was assessed by examination of changes in generation of reactive oxygen species using the 2 ,7 -dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) dye method by flow cytometry (FACScan). Treatment of SH-SY5Y cells for 24 hr with 6-OHDA at various concentrations in ranges from 10 μM to 200 μM decreased the cell viability in a dose-dependent manner. Minimal cell viability was observed in cells treated with 50 μM 6-OHDA. As expected, generation of reactive oxygen species was also increased by 6-OHDA in a dose-dependent manner. Pretreatment of cells for 30 min with 10 μM l-deprenyl significantly lowered cell death induced by 6-OHDA at 50 μM and 100 μM. Furthermore, pretreatment of 10 μM l-deprenyl for 30 min reduced the 6-OHDA-induced generation of reactive oxygen species. These results in SH-SY5Y cells confirmed that l-deprenyl had protective effect against toxicity and oxidative stress, especially induced by 6-OHDA. The neuroprotective effect of l-deprenyl, possibly due to its increased scavenger activity, observed in this study is independent of MAO-B inhibition. In order to investigate whether the action of l-deprenyl is involved in caspase activity, caspase(-3) activity was measured by evaluation of the cleavage of poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) by employing anti-PARP antibody in SH-5YSY cells. Production of 85 kD fragment by the cleavage of PARP was observed in cells treated with 25 μM and 50 μM 6-OHDA. Treatment of cell with l-deprenyl (0.1, 10 and 100 μM) did not show any changes in 6-OHDA-induced cleavage of PARP, indicating no effect of l-deprenyl on 6-OHDA-induced caspase-3 activation. The precise neuroprotective mechanism and intracellular target protein of l-deprenyl should be further examined. l-Deprenyl is metabolized to l-methamphetamine (l-MA), l-amphetamine (l-AM) and l-desmethylselegiline (l-DMS) and recently marketed in Korea. The predominant drug of abuse in Korea is d-MA so that the urine from MA abusers usually contains unchanged d-enantiomer of MA and AM. It is necessary to separate enantiomer of MA for distinguishing the legitimate therapeutic drug use from illegal drug abuse. Therefore, the second set of experiments was performed to separate enantiomer of MA for distinguishing the illicit drug use of MA. The enantiomeric analysis in urine collected from rats administered with l-deprenyl, d-methamphetamine (MA) or dl-MA, and from healthy volunteers ingested with l-deprenyl by capillary electrophoresis (CE) using carboxy methylated-β-cyclodextrin (CMCD) as a chiral selector was investigated to compare the metabolic pattern of l-deprenyl with the metabolism of d- or dl-MA. Urine from illegal drug abusers was also analyzed for the comparison of therapeutic drug (l-deprenyl) use with abuse drug (d-MA) use. MA enantiomers (l-, d-), amphetamine (AM) enantiomers (l-, d-), l-deprenyl and desmethylselegiline (DMS) enantiomers (l-, d-) were simultaneously separated and detected with a clear resolution. l-Deprenyl and its metabolites, l-MA, l-AM and l-DMS were detected in rat urine sample collected up to 24 hours after oral administration of l-deprenyl (10 mg/kg) and the urinary l-AM/l-MA ratio was 2.45±0.55. This AM/MA ratio was significantly higher than those ratios from rats administered with d-MA (5 mg/kg) and dl-MA (10 mg/kg). The d-AM/d-MA ratio was 0.98±0.25 for the d-MA treatment, and the d-AM/d-MA and l-AM/l-MA ratios were 0.72±0.24 and 0.71±0.21, respectively, for the dl-MA treatment. Analysis of human urine, revealed that unlike rat urine, the MA content was much greater than AM content, resulting in the AM/MA ratios being far lower in both cases of healthy adult men ingested with l-deprenyl (10 mg) and MA abusers. The AM/MA ratio from l-deprenyl user (0.33±0.03) was significantly higher than the ratio from MA abusers (0.20±0.12). Results indicate that although metabolic patterns of the drugs in rat and men may be different, the AM/MA ratio from l-deprenyl use is significantly higher than the ratio from MA use in both rat and human urine. This ratio, however, cannot give conclusive proof of l-deprenyl or MA use in men. The simultaneous chiral separation for all the metabolites of l-deprenyl and MA by CE analysis used in this study could provide rapid and simple discrimination between therapeutic drug use and illegal drug abuse.