Mutations of the TATA-binding protein confer enhanced tolerance to ethanol and hyperosmotic stress in Saccharomyces cerevisiae

Abstract

Since elevated ethanol is a major stress during ethanol fermentation, yeast strains tolerant to ethanol are highly desirable for the industrial scale ethanol production. A technology called global transcriptional machinery engineering (gTME), which exploits a mutant library of SPT15 encoding the TATA-binding protein of Saccharomyces cerevisiae, seems to a powerful tool for creating ethanol-tolerant strains. However, the ability of created strains to tolerate high ethanol on rich media remains unproven. In this study, a similar strategy was used to obtain five strains with enhanced ethanol tolerance (ETS1–5) of S. cerevisiae. Comparing global transcriptional profiles of two selected strains ETS2 and ETS3 with that of the control identified 42 genes that were commonly regulated with twofold change. Out of 34 deletion mutants available from a gene knockout library, 18 were ethanol sensitive, suggesting that these genes were closely associated with ethanol tolerance. Eight of them were novel with most being functionally unknown. To establish a basis for future industrial applications, strains iETS2 and iETS3 were created by integrating the SPT15 mutant alleles of ETS2 and ETS3 into the chromosomes, which also exhibited enhanced ethanol tolerance and survival upon ethanol shock on a rich medium. Fermentation with 20% glucose for 24 h in a bioreactor revealed that iETS2 and iETS3 grew better and produced approximately 25% more ethanol than a control strain. The ethanol yield and productivity were also substantially enhanced: 0.31 g/g and 2.6 g/L/h, respectively, for control and 0.39 g/g and 3.2 g/L/h, respectively, for iETS2 and iETS3. Thus, our study demonstrates the utility of gTME in generating strains with enhanced ethanol tolerance that resulted in increase of ethanol production. Strains with enhanced tolerance to other stresses such as heat, fermentation inhibitors, osmotic pressure, and so on, may be further created by using gTME. We demonstrated that strains overexpressing SPT15-M2 or SPT15-M3 were tolerant to hyperosmotic stress caused by high concentrations of glucose, salt, and sorbitol. The enhanced tolerance to high glucose concentrations in particular improved ethanol production from very high gravity (VHG) ethanol fermentations. The strains displayed constitutive and sustained activation of Hog1, a central kinase in the high osmolarity glycerol (HOG) signal transduction pathway of S. cerevisiae. However, the cell growth defect known to be caused by constitutive and sustained activation of Hog1 was not observed. We identified six new genes (GPH1, HSP12, AIM17, SSA4, USV1, and IGD1), the individual deletion of which renders cells sensitive to 50 % glucose. In spite of the presence of multiple copies of stress response element in their promoters, it was apparent that those genes were not controlled at the transcriptional level by the HOG pathway under the high glucose conditions. Combined with previously published results, overexpression of SPT15-M2 or SPT15-M3 clearly provides a basis for improved tolerance to ethanol and osmotic stress, which enables construction of strains of any genetic background that need enhanced tolerance to high concentrations of ethanol and glucose, promoting the feasibility for VHG ethanol fermentation.;에탄올 발효 동안에 주요한 스트레스는 높은 에탄올이기 때문에, 에탄올에 잘 견디는 효모 균주들은 산업 규모의 에탄올 생산을 위해 매우 바람직하다. global transcriptional machinery engineering (gTME)라고 불리는 기술은 Saccharomyces cerevisiae의 TATA-binding 단백질을 encoding 하는 SPT15의 돌연변이의 library을 이용한 것으로 에탄올-내성 균주를 만들기 위해 개발한 것이다. 그러나, rich media에서는 고에틸 알코올의 내성을 위해 만들어진 균주들의 능력이 아직 증명되지 않은 채로 남아있다. 이 연구에서, gTME를 사용하여 S. cerevisiae의 에탄올 내성이 강화된 5개의 균주(ETS1-5)를 얻게 되었다. 그리고 ETS2와 ETS3 두 균주를 선택하여 global transcriptional profile을 비교해보니 일반적으로 조절되었던 42개의 유전인자를 확인하였다. 그 중에 34 deletion mutant는 gene knockout library로부터 이용할 수 있는데, 18개는 에탄올에 민감한 것이었다. 이 유전인자들이 에탄올 내성과 밀접하게 관련되었던 것을 시사하면서 그들 중에서 8개는 기능적으로 알려지지 않았다. 미래 산업의 응용을 위한 기초를 설립하기 위해, iETS2와 iETS3 균주들은 ETS2와 ETS3의 염색체에 SPT15 돌연변이대립유전자들을 통합하여 만들어졌다. 그것들은 또한 rich media에서도 에탄올 스트레스의 에탄올 내성과 생존이 더 강하게 나타났다. 발효기에서 24시간 동안 20 % glucose가 포함된 배지에서 발효를 해 보았더니 iETS2와 iETS3이 더 잘 성장하였고 control보다 대략 25%의 에탄올을 더 생산하였다. 에탄올 생산량과 생산성은 0.31 g/g와 2.6 g/L/h로 향상되었다. 그러므로 이 연구는 gTME에 이용된 균주들은 에탄올 생산에서 에탄올 내성이 증가되는 결과를 가져왔다. 따라서 두 번째 조건으로 높은 글루코오스 농도에 의한 삼투압 스트레스 내성을 알아 보기로 했다. 각 부분에서 높은 글루코오스 농도에서 강화된 내성은 VHG 에탄올 발효로부터 에탄올 생산이 향상된다. 균주는 Hog1의 본질적/구성적이고 지속적인 activation을 보여주는데 이것은 S. cerevisiae의 HOG 시각적인 변화 경로에서 가장 중요한 kinase이다. 그러나 Hog1의 본질적/구성적이고 지속적인 activation에 의해 발생된다고 알려진 세포 성장 결함은 명백히 밝혀지지 않았다. 우리들은 50% 글루코오스 농도에 의해 세포를 민감하게 만든다고 새롭게 알려진 6개의 각각의 deletion 유전자들(GPH1, HSP12, AIM17, SSA4, USV1, IGD1)을 확인하였다. 그들의 promotes 속에서 스트레스 반응 요소의 다중 copies의 존재에도 불구하고, 그 유전인자들이 고글루코오스 상태에 있는 HOG pathway에 의한 transcriptional 레벨에서도 제어되지 않았다는 것은 명백하였다. ETS2와 ETS3의 overexpression 은 분명히 에탄올과 삼투 스트레스 내성이 향상되며 이는 곧 VHG 에탄올 발효를 위해 이 가능성을 촉진하는 고농도 에탄올과 글루코오스에 강화된 내성을 필요로 하는 어떤 유전적 배경의 strains 구성도 가능하게 한다. 따라서 gTME를 이용하여 열, 발효 억제제들, 삼투압, 내성이 강화된 균주들을 만들 수 있다.