Enhancement of cold and salt tolerance by ectopic expression of EcNrdH in Arabidopsis

Abstract

식물은 땅에 고정되어 살아가는 생물체로써, 외부의 환경변화에 대해 그대로 노출되어 있으며, 저온 스트레스, 고염 스트레스, 자외선 노출, 가뭄 스트레스 등의 다양한 환경변화로부터 활성산소 (ROS)가 발생하게 된다. 활성 산소들은 정상적인 범위 내에서는 식물에게 필수적이나, 과다 발생되게 되면 식물의 신호 전달체계와 성장에 큰 영향을 끼치게 된다. 이러한 비 정상적인 활성산소 농도는 식물에게 큰 영향을 미치기 때문에, 식물체 내에는 활성산소를 제거할 수 있는 많은 수의 산화 환원 효소가 존재하고 있다. 모델 식물체인 애기장대에는 31개의 Glutaredoxin (GRX) 유전자가 존재하며, 대장균에서는 5개의 유전자가 존재하고 있다. 상대적으로 수가 적은 대장균의 GRX 유전자를 애기장대에 과다발현 시킨 식물체를 만들었을 때, 그 유전자의 특이성은 떨어지나 더 많은 부분에 영향을 끼칠 것으로 생각되며, 이를 통해서 전반적인 GRX의 기능을 추측해 볼 수 있을 것이라 예상하여, 본 연구에서는 대장균의 GRX 유전자 중 하나인 EcNrdH 를 이용하여 애기장대에 형질전환 시켰다. EcNrdH 형질전환체를 가지고 다양한 생리 스트레스 (저온 스트레스, 고염 스트레스, 가뭄 스트레스, 저산소 스트레스)를 처리해 본 결과, 저온 스트레스와 고염 스트레스에서 형질전환체의 생존률이 증가되었다. 이를 통해 EcNrdH가 식물체 내에서 저온 민감성과 고염 민감성 향상에 영향을 끼친다는 것을 알 수 있었다. 이러한 EcNrdH 유전자가 식물체 내에서 분자적으로 어떠한 영향을 끼쳐, 고염 스트레스와 저온 스트레스 상해서 그 민감성이 증가하였는지 알아보기 위해 EcNrdH 형질전환체를 애기장대 Operon chip을 이용하여 microarray실험을 진행하였다. 그리고 유전자 레벨에서 그 변화 량을 보았을 때 스트레스가 왔을 때 대조 군에서의 유전자 변화만큼, 식물체내에 EcNrdH가 들어감으로써 변화한 유전자의 변화폭도 크다는 것을 알 수 있었다. 이러한 유전자의 변화를 더 자세히 알아보기 위하여 EcNrdH의 영향을 분석하기 위해 coexpression gene set 을 통해 특징적으로 발현하는 유전자 그룹을 분석하였다. 스트레스를 처리하지 않은 EcNrdH 형질전환 체에서 저온스트레스와 관련이 있다고 알려진 DREB1A나, MPK signaling과 관련된 유전자와 같은 유전자들의 발현이 증가되어 있었으며, GRX 그룹에 속하는 유전자뿐만 아니라 산화화원과 관련된 다른 여러 유전자들, 또 호르몬 대사와 관련된 다양한 유전자들의 발현이 증가되어 있는 것을 확인했다. 또한, 성장과 발달 및 대사와 관련된 유전자들의 발현이 약간 저하되어 있는 것을 확인했다. 또한 황동화 과정과 관련된 많은 유전자들이 과다발현되어 있는 것을 확인하였다. 대조군에서는 저온 스트레스가 왔을 때 DREB1나 MPK signaling과 관련된 유전자들의 발현이 증가되는 것은 물론이고, 스트레스를 처리하지 않았던 형질전환체에 비해서는 적은 양이지만 GRX그룹의 유전자들과 호르몬 대사와 관련된 유전자들의 발현이 증가되었다. 반면에 성장과 발달 및 대사와 관련된 유전자들의 발현은 크게 감소하는 것을 확인하였다. 반면에 형질전환체에 저온 스트레스가 왔을 경우, 위에 언급했던 유전자들의 발현의 변화는 크게 보이지 않았으며, 식물체 전반에서 스트레스 처리 후 큰 변화를 보이지 않는 것을 확인하였다. 이를 통해서 EcNrdH 형질전환체에서는 스트레스가 오기전에 이미 저온 스트레스가 왔을 때 변화하는 유전자의 많은 부분이 이미 변화되어 있어서, 저온 스트레스가 왔을 때 미리 준비되어 있기 때문에 저온 스트레스 내성을 가질 수 있는 것으로 보인다. 대조군에서 고염 스트레스가 왔을 때 황동화 과정과 관련된 많은 유전자들의 발현이 증가하며, 산화환원과 관련된 유전자들의 발현 또한 증가되었다. 이와는 대조적으로 EcNrdH 형질전환체에서는 저온 스트레스와 마찬가지로 고염 스트레스내에서 작은 유전자의 변화만 보였다. 그럼으로 이러한 황동화 과정이나 산화환원 관련된 유전자들은 고염 스트레스에서 내성을 가지는데 큰 영향을 끼치며, EcNrdH 형질 전화체의 경우 미리 준비가 되어있기 때문에 스트레스 상황에서 더 잘 견딜 수 있게 되는 것으로 보인다.;Reactive oxygen species (ROS), such as superoxide radicals, hydrogen peroxide, and hydroxyl radicals, are redox signals essential to many physiological processes in both prokaryotes and eukaryotes. Environmental stresses, such as drought, salinity, and chilling, and UV-B radiation lead to the increased generation of ROS in plants. Although ROS are signals essential for plant development, a high concentration of ROS can damage macromolecules and disrupt normal signaling in plants. Many environmental stresses, such as drought, salinity, heavy metals, and abnormal temperatures, can induce excessive accumulation of ROS in plants, which will damage macromolecules and change the normal signaling conduction. To cope with such oxidative damage and insure normal signaling events, plants have developed complex and precisely controlled antioxidant systems by regulating cellular gene expression, which enables organisms to maintain the proteins and other cellular components working as usual. Glutaredoxins (Grxs) are ubiquitous small heat-stable disulfide oxidoreductases, which were first been described as glutathione-dependent reductases, and they can regulate protein activity by reversibly glutathionylating or reducing disulfide bonds in their targets to achieve their roles in the antioxidative responses. Plants contain many Grxs with functions that are not well understood. To understand the effect of EcNrdH, one of the Grxs in E. coli, EcNrdH transgenic Arabidopsis plants were constructed. The EcNrdH transgenic plant did not show significant differential morphological changes, except for a relatively short root length in comparision to wild type. Various abiotic stresses were applied to the EcNrdH transgenic plant to examine the stress sensitivity. The EcNrdH transgenic plant showed enhanced cold and salt tolerance. To gain insight into how the EcNrdH transgenic plant showed enhanced cold and salt tolerance in the gene expression levels, transcriptom analysis was carried out using an Operon Arabidopsis microarray after cold and salt treatment. Hierarchical cluster analysis was performed at the whole genome level. The results showed that the effect of EcNrdH in Arabidopsis was higher than the effect of stress treatment. For the comparative analysis of gene expression between the wild-type plants and the EcNrdH transgenic plants under normal conditions, cold stress, or salt stress, a gene expression analysis was performed using the GSEA method with a coexpression gene set database. In the EcNrdH transgenic plant under normal conditions, numerous genes showed differential expression. To summarize the gene expression in the EcNrdH transgenic plant, it can be observed that transgenic plants down regulated the transcriptional response for the growth control and developmental adjustment and for the metabolic adjustment, whereas they up regulated the transcriptional responses for biotic and abiotic stress, hormone metabolism, and sulfur assimilation. These genes were highly enriched in the wild-type plant under cold or salt stresses, while these genes were only slightly enriched or not enriched in the transgenic plant under the same conditions. These expressed gene sets in the EcNrdH transgenic plant may increase the cold and salt response, so these genes play a role in protecting against cold and salt stress.