Fluorescence Detection of Sequence-selective Metal Ions Binding to Oligonucleotides

Abstract

This study used single-stranded DNA (ssDNA) consisted of same DNA bases for binding various metal ions and gold nanoparticles (AuNPs), based on changes of fluorescence signal according to reactivity of DNA bases and consequent mechanism. In Chapter I, four oligonucleotides listed same eleven bases are reacted with various metal ions sensing DNA bases selectively. We measured and analyzed fluorescence intensity of OliGreen (OG), which is fuorescent that binds to only oligonucleotides. It is possible to sense that increasing of fluorescence signal when metal ions interact selectively to oligonucleotides with OG that binds between DNA bases. To improve previous researches about that thymine binds with mercury ions by forming thymine-Hg-thymine interaction, fluorescence signal of OG increased when only eleven thymines-based oligonucleotides (T11) combined with mercury ions. Also, twenty-two thymines-based oligonucleotides (T22) was examined together to figure out binding form and it was verified by fluorescence according to structural changes into hair-pin shapes when length of DNA is longer. In Chapter II, oligonucleotides from Chapter I were adsorbed to AuNPs and we reported quantitative analysis method for confirming reactivity of four DNA bases (Adenine, Thymine, Guanine, Cytosine) as changes of fluorescence signal. We figured out that no fluorescence signal was shown by using property of oligonucleotides adsorbing on surface of AuNPs easily, which interfere binding with OG. Moreover, fluorescence signal changed with consistent gradient even sequences are longer, and quenching point was confirmed for quantitative analysis for fluorescence. To figure out reactivity of DNA bases, we used different DNA bases listed between oligonucleotides adsorbing onto AuNPs. Adsorption tendency on same concentration of AuNPs was different from same length of guanine-based oligonucleotides when TTA bases between GGGs and we suggested the possiblily of quantitative analysis. In Chapter III, we examined that 5’-end part of fluorophore-labeled oligonucleotides adsorbed to AuNPs. It is hard to figure out that DNA bases adsorb on surface of AuNPs certainly or not, because 5’-end labeling is determined by detecting fluorescence of end-part of the molecules unlike OG’s fluorescence signal. We used two types of fluorophore and fifteen, twenty-five adenine-based oligonucleotides to compare reactivity of each other. For suggesting more definite mechanism, we should examine more oligonucleotides included various bases.;본 논문에서는 같은 DNA 염기로 나열된 단일가닥 DNA를 사용하여 다양한 금속 이온 및 AuNPs에 결합함에 따라 변하는 형광의 세기를 통해 DNA 염기의 반응성과 그에 따른 메커니즘을 연구하였다. Chapter I. 에서는 11개의 같은 염기로 나열된 네 가지 (A, T, G, C) 의 oligonucleotides에 다양한 금속 이온과 결합하여 선택적으로 DNA 염기를 센싱하였다. 이 연구는 oligonucleotides에만 결합하여 형광을 나타내는 물질인 OG 을 사용하여 형광의 세기를 측정하고 분석하였다. OG는 DNA의 염기 사이로 반응하여 선택적으로 금속 이온이 결합하면 형광이 증가하는 것을 통하여 센싱이 가능하다는 것을 알 수 있었다. Thymine은 수은 이온과 반응하여 T-Hg-T 결합을 이룬다는 기존의 연구 결과에 좀 더 자세히 보충하기 위해 11개의 thymine으로만 이루어진 oligonucleotides에 수은 이온을 넣었을 때 선택적으로 형광의 세기가 증가하는 것을 확인하였다. 또한 oligonucleotides의 결합 형태를 알아 보기 위해 T22도 함께 측정하여 DNA의 길이가 길어질수록 헤어핀 모양으로 구조적인 변화가 생긴다는 것을 형광을 통해 증명할 수 있었다. Chapter II. 에서는 앞서 Chapter I 에서 연구했던 oligonucleotides에 AuNPs를 흡착시켜 네 가지의 DNA 염기의 반응성을 알아보고 형광의 세기 변화를 통해 정량적으로 분석하는 방법을 소개하였다. 이 연구는 oligonucleotides가 AuNPs의 표면에 흡착되는 성질을 이용하여 OG과의 결합을 방해하여 형광이 나타나지 않는 것을 알 수 있었다. 또한 시퀀스의 길이가 길어져도 형광의 세기가 일정한 기울기로 변하였으며 형광을 통한 정량적 분석을 하기 위해 Quenching point를 확인하였다. DNA 염기의 반응성을 알아 보기 위해 다른 DNA 염기가 사이에 끼어들어가 나열된 oligonucleotides에 AuNPs에 흡착시켰다. 세 개의 GGG 사이에 TTA 염기가 나열되면 비슷한 길이로 이루어진 guanine-based oligonucleotides보다 같은 농도의 AuNPs에 흡착되는 경향이 달랐으며, 이를 통해 정량적 분석의 가능성을 제시하였다. Chapter III. 에서는 oligonucleotides의 5’-부분에 형광물질을 라벨링하여 AuNPs에 흡착되는 경향을 살펴보았다. 5’-부분에 형광물질을 라벨링하게 되면 OG와는 달리 끝 부분에서의 형광을 측정하기 때문에 DNA 염기가 확실히 AuNPs의 표면에 흡착하는 지의 여부는 확인이 어렵다. 이를 비교해 보기 위해 두 가지의 형광물질을 사용하였으며, 또한 15개, 25개의 Adenine 시퀀스를 가진 oligonucleotides를 서로 비교하여 반응성을 확인하였다. 이 연구는 좀 더 명확한 메커니즘을 제시하기 위해서 다양한 염기를 가진 oligonucleotides를 사용하여 확인해 볼 필요가 있다고 판단된다.