Functional Study of Fusion Genes Discovered from Non-Small Cell Lung Cancer Tissues of Never Smoker Female Patients

Abstract

폐암은 전 세계적으로 높은 사망률을 차지하는 암이다. 또한 폐암은 조직형에 따라 크게 소세포 폐암 (Small cell lung cancer; SCLC) 와 비소세포 폐암 (Non-samll cell lung cancer; NSCLC) 으로 나뉘는데, 특히, NSCLC는 화학 항암치료가 잘되지 않는 것으로 알려져 있기 때문에 표적 치료제의 개발이 중요하다. 폐암의 주된 발병요인은 흡연이지만 세계적으로 폐암 환자의 대략 25%가 전혀 담배를 피우지 않은 비흡연자이다. 비흡연자에게서 발생하는 폐암은 유전자 돌연변이에 의해 발생하며, 조직형은 NSCLC, 그 중에서도 lung adenocarcinoma가 높은 비율을 차지한다. 알려진 대표적인 유도 돌연변이 (driver mutation) 는 EGFR의 tyrosine kinase domain의 mutation, KRAS의 point mutation, 그리고 염색체 재배열 (chromosomal rearrangement) 에 의해 생성되는 EML4-ALK fusion gene이다. 그러나 이 driver mutation이 발견되지 않는 많은 폐암 환자가 있으므로 표적 치료를 위한 새로운 driver mutation을 발견하고자 한다. 기존의 선행연구로써, Next generation sequencing (NGS) 기술을 이용하여 비흡연 여성 NSCLC 환자 조직으로부터 20개의 fusion gene이 발굴되었다. 본 실험에서는 이 20개의 fusion gene들 중, CDS 부분의 fusion 연결이 in frame으로 이어지는 9개의 fusion gene들에 대하여 fusion CDS 부분의 클로닝을 진행하였다. 그리고 이 중, 4개의 fusion gene에 대하여 암유전자로서의 기능 수행 및 세포의 형질전환에 영향을 주는지 알아보기 위해 단백질의 기능 연구를 하였다. 4개의 fusion gene이 oncogenic한 성질을 나타내는지 알아보기 위해 colony formation assay를 이용하여 세포 증식 능력을 관찰하였다. 그 결과, colony 수에 대해서는 큰 차이를 볼 수 없었지만 형성되는 colony의 크기는 negative control 비해 fusion gene에서 상대적으로 큰 것으로 관찰되었다. 또한, 4개 fusion gene 중에서 NUPL1-ZDHHC20에 대하여 NUPL1과 ZDHHC20 그리고 이 두 단백질이 융합된 형태인 NUPL1-ZDHHC20이 세포 내 에서 발현되는 위치를 비교하기 위하여 immunofluorescence assay를 실시하였다. 그 결과, Nucleoporin인 NUPL1은 핵에서만 관찰될 거라는 예상과 다르게 핵과 세포질에 골고루 퍼져 있는 것으로 관찰된 반면, NUPL1-ZDHHC20 fusion protein은 세포질에서만 관찰되었다. 이 결과로 보아 NUPL1이 ZDHHC20과 fusion을 이루면 핵으로의 localization이 제한되는 것으로 추정된다. 본 실험은 선행 연구에서 이루어진 비흡연 여성 NSCLC 환자의 암 조직으로부터 찾은 새로운 fusion gene들을 실험적으로 검증하는 과정이었다. Colony formation assay를 이용하여 empty vector에 비해 fusion gene 후보들에서 비교적 크기가 큰 colony가 많이 관찰되었으나 전체 colony 수에 대해서는 눈에 띄는 증가가 관찰되지 않았다. 이 점에 대해서는 비부착증식 (anchorage-independent growth) 을 알아보는 soft agar colony formation assay를 수행해 본다든지 하는 실험 디자인의 수정이 필요하다. 또한, immunofluorescence assay를 이용하여 NUPL1-ZDHHC20의 fusion 전과 후 세포 내 발현 위치의 변화를 확인하였으며, 그 기능에 대하여 연구가 부족한 유전자이므로 각 단백질의 성질을 알아보는 실험 디자인이 필요하다.; Lung cancer remains a leading cause of cancer deaths worldwide. And Lung cancers are largely classified as small cell lung cancer (SCLC) and non-small cell lung cancer (NSCLC) based on histological types. Especially, it is known that NSCLC is poorly sensitive to chemotherapeutic treatment, therefore, development of NSCLC-targeted agents is important. Major risk factor of lung cancer is smoking, however, approximately 25% of lung cacer patients worldwide are never smokers. Lung cancer in never smokers tends to be driven by genetic mutations, and adenocarcinoma, subset of NSCLC, have large proportion of lung cancer of never smokers as histological types. Well-known representative driver mutations of NSCLC are mutations in the tyrosine kinase domain of EGFR, missense mutations in KRAS, and EML4-ALK fusion gene generated by chromosomal rearrangement. However, there are many lung cancer patients observed to have none of known driver mutations in their cancer genome. To identify new driver mutation of NSCLC for targeted therapy, the study about the cancer tissues of never smoker female NSCLC patients was performed. Through preceding researches, 20 fusion genes were detected from NSCLC tissues of never smoker female patients using the next generation sequencing (NGS) techniques. About 9 fusion genes consisting of in frame CDS, gene cloning was performed in this experiment. And of these, about 4 fusion genes, protein functional study was done to find out whether or not they contribute to fusion as cancer driver gene and cellular transformation. Cell proliferation level of 4 fusion genes was observed using colony formation assay. Compared with negative control, their colony number is not significantly different, however, colonies of larger size are observed more in fusion genes. Also, about NUPL1-ZDHHC20 among the 4 fusion genes, immunofluorescence assay was carried out in order to compare the locations of NUPL1, ZDHHC20 and NUPL1-ZDHHC20 fusion protein expressed in the cell. NUPL1 appeared widespread in nucleus and cytoplasm, against expectation that it would be observed in the nucleus. Whereas NUPL1-ZDHHC20 fusion protein was observed only in cytoplasm. This result shows if NUPL1 and ZDHHC20 are fusioned, and nuclear position is blocked. This experiment was process that verify novel fusion genes discovered from NSCLC tissues of never smokers female patients performed in preceding researches. Through colony formation assay, relatively larger size colonies were observed in fusion gene candidates compared with empty vector. However, no striking increase was observed about the total colony number. On this point, it is required for modification of experimental design such as soft agar colony formation assay for anchorage-independent growth. In addition, using immunofluorescence assay, location of before and after of fusion about NUPL1-ZDHHC20 expressed in the cell was verified. And because of genes lacking of research about their function, experiment design is required for investigating property of each gene.