Actinobacillus succinogenes의 C₄-dicarboxylate 수송시스템 연구

Abstract

Actinobacillus succinogenes fermented glucose to the major products succinate, acetate, formate and ethanol. In addition, C4-dicarboxylate such as succinate, fumarate, malate and oxaloacetate is produced intermediate of citric acid cycle. In this study, cultivation condition for succinate metabolism of A. succinogenes was established and transport system of C4-dicarboxylate was investigated. In the optimization process of CO2 and gas phase for high production of succinate of A. succinogenes, the result showed that quantity of succinate and ethanol production was influenced by concentration of NaHCO3. Under the condition conducive for high production of succinate (NaHCO3 40 mM, H2 5%•N2 95%), growth rate and doubling time was 0.107h-1, 2.25h, respectively. Under this condition, HPLC was used to analyze production of fermentation products over time. Moreover, complimentation test were performed if 6 C4-dicarboxylate transport protein of A. succinogenes fulfills the role of C4-dicarboxylate transport function in E. coli. As a result, the test confirmed that Asuc_0304 complements uptake function of fumarate and malate in E. coli. Furthermore, Asuc_0304 showed that gene expression is induced by carboxylate through β-galactosidase test.; Actinobacillus succinogenes는 글루코오스 발효 시 주요 발효산물로써 숙신산, 아세트산, 포름산, 에탄올을 생산한다. 또한 숙신산, 푸마르산, 말산 및 옥살로아세트산과 같은 C4-dicarboxylate는 시트르산 회로의 중간 물질로써 생산되어진다. 본 연구에서는 A. succionogenes의 숙신산 대사를 위한 배양조건을 확립하였고, C4-dicarboxylate 수송시스템에 관해 연구하였다. A. succionogenes의 숙신산 고생산을 위한CO2 농도와 gas phase의 최적화의 과정에서 숙신산과 에탄올의 생성량이 NaHCO3의 농도에 따라 영향을 받는 것으로 나타났다. 숙신산 생성량이 높은 성장조건(NaHCO3 40 mM, H25%•N295%)에서 성장속도와 분열시간은 0.107h-1, 2.25h였다. 이 조건에서 HPLC를 사용하여 시간에 따른 발효산물의 생성량을 정량하였다. 또한 A. succionogenes의 6가지 C4-dicarboxylate 수송단백질이 E. coli 에서 C4-dicarboxylate 수송기능을 하는지를 상보성 실험을 통하여 알아보았다. 그 결과 Asuc_0304가 E. coli에서 푸마르산과 말산의 uptake 기능을 상보한다는 것을 확인하였다. 나아가 β-galactosidase test에 의해Asuc_0304 유전자가 carboxylate에 의해 유전자발현이 유도되는 것을 보였다.