저속 냉동법이 사람 제3대구치의 배양된 치주 인대 세포 활성도에 미치는 영향

Abstract

Purpose; The aim of this study was to examine the effect of a slow programmable cryopreservation procedure on human periodontal ligament (PDL) cell cultures could be useful for tooth banking. Cryopreservation of teeth for delayed transplantationmight be one of the treatment modality for restoration in dentistry. Material and Methods; Human PDL fibroblasts obtained from immature third molars were cultured and divided into two groups. The experimental group was cryopreserved with 10% DMSO, a slow freezing rate of 0.5℃/min from 4℃ to -35℃ followed by plunging in liquid nitrogen at -196℃ and cultured after fast thawing . The control group was cultured without cryopreservation. A comparison was made between cryopreserved and control cells. To evaluate possible differences in the characteristics of the fibroblasts, the cells in both groups were tested for viability (membrane integrity), growth capacity. The Wilcoxon test for paired comparison between cryopreserved and non-cryopreserved cells was performed for each characteristic. Results; The membrane integrity of cells was not influenced by cryopreservation. There was no statistically significant difference in growth capacity between cryopreserved and control cells. Conclusion; These results suggest that cryopreservation under controlled conditions does not influence the viability nor the proliferation capacity of human PDL cells in vitro.;본 연구의 목적은 저속냉동이 사람 치주 인대 세포의 생존능력과 성장능력에 미치는 영향을 평가하는데 있으며 저속 냉동한 치주인대 세포와 냉동하지 않은 치주인대세포의 활성도를 비교함으로써 치주인대세포를 장기간 보관하는 방법으로 저속냉동의 임상적 유용성을 밝히고자함이다. 자가 치아이식은 구강 내에 매복되어 있는 자기 치아를 다른 결손 부위로 이식하여 치아의 고유기능을 회복시켜주는 술식으로 주로 악골에 매복되어 있는 제 3대구치를 상실된 제 1대구치 부위로 옮기거나, 상악에 묻혀 있는 송곳니를 제자리에 외과적으로 위치시키고, 하악에서 작은 어금니를 다른 위치로 옮겨 심는 술식이 주로 시행된다. 건강하고 적절한 공여치가 이식된다면 자가 치아이식은 매우 예지성 있는 치료법이다. 치아이식의 성공은 여러 요인 즉, 이식시 초기 안정, 공여치의 구강 외 노출시간, 수술시간, 치주인대 조직의 조작과 보호 등에 의해 영향을 받는다. 이 가운데 가장 중요한 요소는 발거된 치아의 치근 면에 생착된 치주인대세포의 활성도를 유지하는 것이다. 그러므로 치아의 냉동보존 시 치주 인대 세포의 생존과 기능을 유지할 수 있다면 냉동보존은 치아이식과 재식을 위하여 치아를 장기간 보존 할 수 있는 유용한 방법이다. 실험에 사용한 사람 치주인대 세포는 발거한 미성숙 제 3대구치로 부터 획득하였다. 미성숙 제3대구치로부터 획득한 치주인대 섬유아세포를 배양하여 2개군으로 나누어 실험군은 프로그램 냉동속도 조절기를 사용하여 -35℃까지는 -0.5℃/min 속도로 저속 냉동하고 -35℃ 이하 온도에서는 세포 내부에 얼음 결정이 생기지 않고, 세포 외부의 냉동환경에 반응해서 세포가 수축하기 때문에 -35℃ 이하부터 -196℃ 까지는 액체 질소통을 사용하여 급속 냉동을 하였다. 냉동한 실험군은 급속해동 후 배양하였고 대조군은 냉동보존 하지 않고 배양하였다. 냉동에 사용된 동해방지제는 10% DMSO 동해방지제를 사용하였다. 실험에 사용한 세포는 3차 계대세포를 사용하였으며 배양한 냉동군과 대조군의 섬유아 세포의 특징에 있어서의 생존능력(viability)의 차이를 평가하기 위하여 Trypan blue 염색으로 2개군의 생존세포수의 비율을 비교하고 MTT를 통하여 실험군과 대조군의 성장능력(growth capacity)을 시험하였다. 냉동 보존군과 비 냉동보존군의 대응비교를 위하여 Wilcoxon test를 시행하였다. 본 연구는 저속냉동 보존한 치주인대 세포와 대조군의 세포 생존력 및 성장 능력이 유의한 차이가 없는 결과를 얻었다. 이는 저속 냉동시 냉동과 해동의 과정이 치주인대 세포의 생존 및 성장 능력에 부정적 영향을 주지 않으며, 저속 냉동이 치아를 장기 보존하는 방법으로 유용함을 보여 준다. 따라서 상실치 수복에 있어서 치아은행을 위한 치아의 냉동보존은 임상적 적용 잠재력이 있으며 치아은행 냉동보존 프로토콜은 냉동보존액의 종류, 농도, 처리시간, 처리 시 온도, 단계별 용액농도 평형과정(equilibration)의 유무, 냉동속도, 냉동방법, 냉동보관 기간 등이 특기되어야 할뿐 아니라 비용과 효율성 등이 고려되어야하므로 다양한 연구 방법이 계속되면 그 임상적 유용성이 더욱 증대될 것으로 생각한다.