SHP-2 Binds to Caveolin-1 and Regulates Src Activity via Competitive Inhibition of Csk in Response to H₂O₂ in Astrocytes

Abstract

Reactive oxygen species (ROS), such as superoxide (O2-), hydrogen peroxide (H2O2), and hydroxyl radicals are well known as signal regulatory molecules in the brain and can lead to the development of diverse neuropathological conditions. It has been reported recently that SHP-2 is translocated into lipid rafts and activated in response to H2O2, and that caveolin-1 is involved in the ROS-induced SHP-2 activation. However, the function of SHP-2 is poorly understood at present. In the present study, it was demonstrated that caveolin-1 interacted with SHP-2 in response to H2O2. Using co-immunoprecipitation assays, it was found that SHP-2, like Csk, bound only to the wild- type caveolin-1 with phosphorylated tyrosine and not to the phosphorylation-deficient mutant of caveolin-1 (Y14A). Next, in situ proximity ligation assay (PLA) was conducted to examine the interaction among caveolin-1, SHP-2, and Csk in response to H2O2. Using peptide arrays, it was found that both SHP-2 and Csk bound specifically to the phosphorylated caveolin-1 but not the unphosphorylated caveolin-1. In the presence of Csk siRNA, compared to GFP siRNA, the binding between caveolin-1 and SHP-2 was enhanced by H2O2 treatment, leading to reduced Src phosphorylation at tyrosine 527 (Tyr 527) and enhanced Src phosphorylation at tyrosine 416 (Tyr 416). In contrast, siRNA targeting SHP-2 facilitated H2O2-mediated binding between caveolin-1 and Csk, resulting in an inverse effect on Src phosphorylation at Tyr 527 and Tyr 416. Collectively, these results indicate that in the presence of H2O2, SHP-2 bound to caveolin-1 and regulated Src activation through the competitive inhibition of Csk in astrocytes.;활성산소종 (Reactive Oxygen Species)은 생체 내 기관에 손상을 입힐 수 있는 변형된 산소로, 중추신경계에 속하는 뇌에서 신호 전달 물질로 알려져 있다. 활성산소종이 세포 증식, 세포 사멸 활성화 및 억제, 유전자 전사 과정 조절과 같이 다양한 세포 조절 과정에 관여한다는 것이 보고되었다. 최근의 연구결과를 통해 활성산소종에 노출된 성상세포종에서 인산 가수분해 효소인 Src homology 2 domain-containing protein tyrosine phosphatase 2 (SHP-2)와 c-Src tyrosine kinase (Csk)가 막내재 단백질인 Caveolin-1과 각각 상호작용 한다는 점이 보고되었다. 그러나 Caveolin-1, SHP-2, Csk 간의 정확한 상호 작용 메커니즘이 보고된 바가 아직 없어, 이 세 분자가 성상세포종에 미치는 신호 전달 영향에 대해 알아보고자 하였다. 본 연구에서는 성상세포종 세포주에 hydrogen peroxide (H2O2) 처리 후 변화를 확인하였다. CRT-MG, U87-MG, U251-MG 와 같은 사람 교모세포종 세포주에 H2O2 를 처리하여 immunoblotting 을 수행한 결과 H2O2 를 처리한 군에서 caveolin-1 의 활성화가 일어나는 것을 확인하였다. 또한, 단백질 간 상호 작용을 확인 할 수 있는 co-immunoprecipitation (Co-IP) 을 진행하였다. 그 결과, H2O2 를 처리하지 않은 대조군과 H2O2 를 처리한 caveolin-1 tyrosine 14 잔기 돌연변이 (Y14A) 주입군과 달리 H2O2 를 처리한 caveolin-1 Wild-type 군에서 caveolin-1 과 SHP-2, caveolin-1 과 Csk 의 상호 작용이 일어남을 확인하였다. H2O2 로 유도되는 caveolin-1 과 SHP-2 의 상호 작용은 in situ proximity ligation assay (PLA) 기법을 이용해 다시 한번 관찰하였다. 또한, 세 분자 간의 정확한 상호 작용 부위를 규명하기 위해 caveolin-1 phosphopeptides membrane 을 제작해 peptide array 를 수행하였다. 실험 결과, SHP-2 와 Csk 모두 caveolin-1 tyrosine 14 잔기에 직접 결합하는 것을 확인하였다. 또한, 표면 플라스몬 공명 (SPR) 기법을 통해 SHP-2 와 Csk 분자가 caveolin-1 에 비슷한 친화도를 가지고 결합함을 확인하였다. siRNA 를 이용해 SHP-2 를 억제하였을 때, H2O2 자극에 의한 caveolin-1 과 Csk 의 상호 작용이 증가하고, Csk 를 억제하면 H2O2 로 유도된 caveolin-1 과 SHP-2 의 상호 작용이 늘어나는 것을 확인하였으며, siRNA와 PTPi IV 를 이용하여 SHP-2 의 발현 및 기능을 억제하였을 때, H2O2 에 노출된 성상세포종 세포주에서 Src 활성이 억제됨을 확인할 수 있었다. 이러한 연구 결과를 통해 성상세포종에서 H2O2 자극에 의해 caveolin-1 의 인산화가 유도되고, SHP-2, Csk 는 인산화 된 caveolin-1 tyrosine 14 잔기 부위에 경쟁적으로 결합함을 알 수 있다. 본 연구를 통해 성상세포종에서 Caveolin-1 과 SHP-2, Csk 의 결합 기전과 Src 활성을 조절할 수 있는 SHP-2 와 Csk 의 분자적•생리적 메커니즘을 밝혔으며, 이 연구 결과는 성상세포종의 생존, 증식 및 사멸에 대한 이해를 도울 수 있을 것으로 판단된다.