Cytosolic antioxidant enzymes regulate TNF-α-induced apoptosis via distinct pathway

Abstract

Tumor necrosis factor-α (TNF-α) is a pleiotrophic cytokine which induce the activation of NF-κB, MAP kinases, and cell death. TNF-αinduces the programmed cell death under the condition, where NF-κB activation is defective, concomitant with robust increase of reactive oxygen species (ROS). Intracellular signaling processes including the inhibition of NF-κB activation and increase of ROS are prerequisite for the induction of cell death programming, but the mechanism for how these ROS involve in TNF-α induced cell death programming is not fully understood. In Part I, in order to elucidate the molecular mechanisms underlying the involvement of ROS in TNF-α-induced cell death, I paid attention to most antioxidant enzymes including catalase, glutathione peroxidase, and peroxiredoxin which are H2O2-reducing peroxidases. The function of antioxidants in TNF-α signaling was identified by the depletion of each antioxidant enzymes using RNAi interference. Systematic depletion of cellular H2O2-reducing peroxidases using RNA interference revealed that ablation of cytosolic antioxidant enzymes augments both the biphasic H2O2 level, and cytosolic antioxidants enzymes have no influence on necrotic cell death. Moreover, the cell death aggravated in cytosolic antioxidant protein depleted cells was caspase dependent and abolished in bcl2/xL overexpressing cell lines, which mean that cytosolic antioxidant enzymes regulate TNF-α-induced apoptosis upstream of mitochondria and participate intrinsic apoptosis pathway. In Part II, I further investigated which molecule was regulated by each cytosolic antioxidant enzyme in TNF-α-induced apoptosis. As a result, among cytosolic antioxidant enzymes, GPx I have a dominant effect on stress kinase activation including p38 and JNK, and these kinase could regulate TNF-α-induced apopotosis in GPxI depleted cells. Moreover, upstream kinase activity of ASK1 also increased in a Trx1 dependent manner when GPxI is depleted. Surprisingly, PrxII only influences caspase 8-dependent apoptosis through enhance of cIAPs degradation in TNF-α signaling. Finally, depletion of PrxI activates H2AX- and ATR-chk1 associated DNA damage in TNF-α induced cell death. Collectively, these results suggest a novel mechanism underlying the selective action of intracellular ROS, precisely H2O2, in TNF-α-induced apoptosis.;TNF-α는 NF-κΒ, MAP키나아제, 세포 사멸을 유도하는 사이토카인이며 특히 NF-kB가 저해된 상태에서 세포사멸을 유도할 뿐만 아니라 활성 산소종의 생성 또한 촉진한다. 그리고 이러한 활성 산소종이 세포괴사에 연관되어 있다는 것이 밝혀져 왔지만 세포사멸에 어떤 역할을 하는지는 아직 잘 알려져 있지 않다. 본 논문의 전반부에서는 활성산소종이 TNF-α에 의한 세포사멸에 어떤 분자생물학적인 역할을 수행하는지 알아보기 위한 실험을 진행하였다. 이를 위해 RNA interference방법을 사용하여 카탈라아제, 글루타티온 peroxidase(GPx), peroxiredoxin(Prx)을 포함하는 대부분의 세포 내에 존재하는 항산화 효소를 제거하였다. 이러한 다양한 항산화효소 중에서도 특히cytosol에 존재하는 항산화 효소, 즉 Prx1, Prx2, GPx1을 제거하였을 때 TNF-α에 의한 세포사멸이 증가하는 것을 볼 수 있었다. 게다가 cytosol에 존재하는 항산화효소를 제거하였을 때 TNF-α에 의한 H2O2의 생성이 이상성 현상으로 증가했고 caspase 의존적 세포사멸이 유도되며 이러한 현상은 세포괴사와는 무관하다는 것을 알 수 있었다. 특히 Bcl-2와 Bcl-xL의 과발현 세포를 사용하여 미토콘드리아 의존적인 내인성 세포사멸에 관여하였으므로 이러한 cytosol 에 존재하는 항산화 효소는 미토콘드리아의 상위에서 TNF-α에 의한 세포사멸을 조절한다는 것을 알 수 있었다. 본 논문의 후반부에서는 TNF-α에 의한 세포사멸 신호에 관련된 물질 중 어떠한 물질이 어떠한 기작으로 각각의 cytosol 항산화 효소에 의한 세포사멸에 관여하는지 알아보기 위한 실험을 진행하였다. 우선MAP 키나아제의 저해제를 처리한 후 TNF-α에 의한 세포사멸과정에서 GPx1을 제거하였을 때 p38과 JNK에 의한 세포사멸이 조절되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 GPx1의 제거에 의한 활성 산소종의 증가로p38과 JNK의 상위에 존재하는 Trx1의 산화 정도가 증가되어ASK1의 활성화가 일어나기 때문이라는 것을 알 수 있었다. 또 다른 TNF-α에 의한 세포사멸에 관련된 물질인Caspase-8의 활성화는 GPx1과 Prx2가 제거되었을 때 증가하는 것을 볼 수 있었는데 놀랍게도 이는 Prx2가 제거되었을 때 cIAP의 분해가 촉진되기 때문이라는 것을 알 수 있었다. Prx2 의 제거로 인한cIAP의 분해로 RIP1 의존적으로 caspase-8 의 활성도가 증가하여 세포사멸이 증가되었다는 것을 알 수 있었고 이는 cIAP를 제거한다고 알려져 있는smac mimetic과 유사한 효과를 보이는 것을 확인할 수 있었다. 무모생쥐로Prx2가 제거된 HeLa 암세포주를 이종이식시킨 결과 대조군 이종 이식시킨HeLa 세포주와 달리 Prx2가 제거된 HeLa 세포주는 암종양이 자라는 것이 매우 저해되는 것을 확인할 수 있었다. 한편 Prx1은 제거되었을 때 TNF-α에 의해 DNA 상해가 유도된다는 것을 H2AX의 군집이 나타나는 것으로 확인할 수 있었다. 이는 DNA상해에 의한 세포사멸에 관련된 물질 중 특히 ATR에 의해 조절되는 것으로 보아 아마도 Prx1이 제거되었을 때replication error에 의한 DNA 상해가 연관되어 있을 것이라는 것을 알 수 있었다. 본 논문에서는 H2O2가 세포사멸 신호를 촉진시키는 매개체로서 역할한다는 것을 제시하고 있으며 이를 세포 내에 존재하는 각각의 항산화 효소를 제거하는 방법으로 규명하였다. 비록 TNF-α에 의한 H2O2가 어떻게, 어디에서 생성되는지는 밝혀내지 못했지만 TRAIL과 같은 사이토카인이 항암 치료제로서 쓰이고 있다는 점을 미루어볼 때 이러한 cytosol에 존재하는 항산화 효소를 저해하는 방법을 함께 사용한다면 항암 치료에 있어 새로운 방향을 제시할 수 있을 것으로 생각한다.