Identification and characterization of ADCY3 as a novel gene in human gastric cancer

Abstract

이 연구에서는 새로운 위암 진단표지자 또는 위암 관련 유전자를 밝히기 위해, microarray를 이용하여 도출된 위암 조직과 정상 조직 간의 발현 차이로부터 정상 조직 보다 위암 조직에서 더 높은 수준으로 발현하는 유전자를 파악하고 그 중에서 현재까지 종양형성과 관련하여 연구 된 적이 없는 유전자 7개를 (ADCY3, PPRC1, GLT25D1, LOC196463, FAM38A, FAM62A, AYTL2) 먼저 선정하여 RT-PCR 과 qRT-PCR을 이용하여 후보 유전자의 mRNA 발현 차이를 확인하였다. 그 결과, 정상세포주와 정상 조직과 비교하여 위암 세포주와 위암 조직에서 mRNA 발현 차이가 가장 큰 ADCY3 유전자를 표적후보유전자로 선정하였다. ADCY3 유전자는 adenosine triphosphate (ATP)를 2차 전달자인 cyclic AMP (cAMP)로 가수분해 시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있지만 아직 세부적인 생물학적 기능에 대해서는 잘 밝혀져 있지 않다. 단백질 발현을 살펴본 결과, mRNA 발현과 동일하게 대부분의 위암 세포주에서 정상 세포주보다 높게 나타났으며 Northern blot analysis를 통해 위암 외의 다른 암종의 세포주에서도 높은 발현을 볼 수 있었다. 그러나 이 실험을 통해서 alternative splicing variant는 확인 할 수 없었다. 위암에서의 ADCY3의 기능적 영향을 알아보기 위해 Small interfering RNA (siRNA)를 이용하여 ADCY3 유전자를 silencing 시키거나 ADCY3를 과발현 시켜 보았을 때, 이 유전자를 silencing 시킨 세포주에서는 변화가 없었지만 ADCY3 유전자를 과발현 시킨 세포주에서는 mobility와 proliferation 능력이 현저히 증가하였다. 추가로 ADCY3 유전자의 발현을 조절하는 기작을 찾기 위해 promoter 부위의 DNA methylation을 분석한 결과, 위암 세포주에서 ADCY3 promoter 부분의 DNA methylation 수준과 mRNA 발현 수준이 상당히 연관성이 있다는 것을 확인하였다. 본 연구는 ADCY3 유전자가 위암 특이적으로 발현한다는 것을 밝혔으며 이 발현이 DNA methylation에 의해 조절된다는 것을 알아냈다. 또한 이 유전자가 세포의 mobility와 proliferation의 변화를 일으킨다는 것을 보였으며, 이를 통해 위암의 형성에 중요한 역할을 할 것이라는 것을 보임으로서 ADCY3 유전자가 위암의 진단용 분자 표지자 또는 치료 타겟으로 쓰일 수 있는 가능성을 제시했다.;In order to identify novel molecular biomarkers and/or tumor-related genes for gastric cancer, the gene expressions of gastric cancer and normal tissue were analyzed based on microarray data. For my subject, seven (ADCY3, PPRC1, GLT25D1, LOC196463, FAM38A, FAM62A, AYTL2) genes were primarily chosen, based on the criteria that they were overexpressed in cancer tissues and had no reported association with tumorigenesis to date. Of these, ADCY3 gene was finally selected as the target gene since it showed the highest tumor specific overexpression of mRNA in gastric cancer cell lines and tissues according to the RT-PCR and qRT-PCR results. Although ADCY3 gene is known to be involved in the conversion of ATP into the universal second messenger cyclic adenosine-3’, 5’-monophosphate (cAMP), its principal biological function remains unclear. In this study, I found that the protein and mRNA level of ADCY3 are upregulated in gastric cancer cell lines and tissues. Northern blot analysis confirmed this in diverse cell lines, but alternative splicing variants were not detected. The functional effect of ADCY3 in gastric cancer was examined in a cell line by gene silencing and overexpression. Even though gene silencing using siRNA did not show any detectable functional changes in the cell line, the capacity of cell mobility and proliferation was increased when ADCY3 was overexpressed. Subsequently, the DNA methylation status of ADCY3 promoter regions showed significant correlation with its expression patterns in gastric cancer cell lines. Taken together, this study demonstrates the possible role of ADCY3 gene in the tumorigenesis of gastric cancer by changing cell mobility and proliferation. Here, I propose the ADCY3 gene as a novel gastric cancer associated gene and subsequently a future candidate target for diagnosis and treatment of gastric cancer. Further studies on the molecular mechanisms will be needed to elucidate how the ADCY3 mediated cell mobility and proliferation in the progression of cancer.