Pharmacokinetics of acetaminophen and its metabolites in normal and pseudo germ-free rats

Abstract

The gut microflora affects host’s physiological activities including absorption, distribution, metabolism and excretion of the drugs and other xenobiotics. To see how the gut microflora affects the drug metabolism, acetaminophen (APAP) was administered orally and its pharmacokinetics was compared in normal and pseudo germ-free rats. For this study, we developed a simple and effective LC-MS/MS method for the quantification of APAP and its 6 major metabolites. The analytes were separated through a C18 reverse phase column and quantitatively measured within 16 min run by LC-MS/MS. Validation parameters such as accuracy, precision, recovery, matrix effect and stability were found to be within acceptance criteria (within 15% in all QCs and within 20% in LLOQ), indicating that the assay is applicable to measure the concentrations in the range studied. As a result, we developed and validated LC-MS/MS assay method for the determination of APAP and its 6 metabolites in rat plasma samples using both positive and negative detection modes. Pharmacokinetic studies of APAP in pseudo germ-free and control rats were performed after the single oral administration of APAP at a dose of 200 mg/kg. Pseudo germ-free rats were prepared by oral administration of antibiotic cocktails (neomycin, streptomycin, bacitracin) twice a day at a dose of 200 mg/kg each for five days. Water was orally administered to control rats instead of antibiotics. Plasma was collected following the time schedules and analyzed using the validated LC-MS/MS method. The pharmacokinetic parameters of APAP and its metabolites were estimated by non-compartment model on WinNonlin?? program. The area under the plasma concentration-time curve (AUC) values of APAP and acetaminophen glutathione (APAP-Glth) in the pseudo germ-free group were significantly higher than the control group (p<0.05). To estimate the metabolic change, the AUCmetabolites/AUCAPAP was calculated. As a result, the AUCAPAP-Sul/AUCAPAP was significantly decreased in pseudo germ-free group as compared with the control group (p<0.01). The results indicated that the pharmacokinetics of APAP and its 6 metabolites could be altered by the presence or absence of gut microflora. And gut microflora may play important role in the metabolism of xenobiotics. It has been known that the liver is a major organ for the metabolism of most of drugs, but now the role of gut microflora in drug metabolism should be considered as well.;장내 미생물은 약물이나 다른 생체 이물의 흡수, 분포, 대사, 배설과 같은 숙주의 생리학적 활성에 영향을 미친다. 장내 미생물이 약물의 대사에 어떠한 영향을 미치는지를 알아보기 위해서, 아세트아미노펜(APAP)을 정상 대조군과 pseudo germ-free군에 경구로 투여하였고, 그것의 약물동태학적 특성을 비교하였다. 이를 위해 본 연구에서는 APAP과 이 약물의 6가지 대사체를 정량분석할 수 있는 간단하고 효과적인 LC-MS/MS 분석방법을 확립하였다. 분석물질들은 C18 역상 컬럼을 통해 분리하였고, LC-MS/MS를 이용하여 16분간 정량적으로 측정하였다. 정확도, 정밀도, 직선성, 특이성, 감도와 같은 밸리데이션 파라미터들은 모두 기준(모든 QCs에서 15% 이하, LLOQ에서 20% 이하)에 만족하였고, 이는 본 연구에서 확립된 정량법이 연구범위 내에서 측정되는 모든 농도에 적용될 수 있음을 의미하였다. 따라서, 본 연구에서는 흰쥐 혈장 내의 APAP과 6가지 대사체를 positive와 negative 검출모드를 이용하여 측정할 수 있는 LC-MS/MS 정량방법이 개발 및 검증되었다. APAP을 200 mg/kg 의 용량으로 pseudo germ-free군과 정상 대조군에 단 회 경구 투여한 후에 약물의 체내 동태를 검토하였다. Pseudo germ-free 쥐는 항생제 칵테일(네오마이신, 스트렙토마이신, 바시트라신)을 각 200 mg/kg 용량으로 5일간 하루에 두 번씩 경구 투여함으로써 준비하였다. 정상대조군은 항생제 칵테일 대신에 물을 동일한 방법으로 투여하였다. 약동학 실험을 진행하면서 정해진 시간 간격에 따라 혈액을 취하였고, 이 중 혈장성분을 분리하여 앞에서 검증된 LC-MS/MS 방법을 이용하여 분석하였다. APAP 및 그 대사체의 약물동태학적 파라미터들은 WinNonlin?? 프로그램의 non-compartment model을 이용하여 추정하였다. Pseudo germ-free 군에서 APAP 및 이의 글루타치온 포합체(APAP-Glth)의 AUC 값이 정상 대조군에 비해 유의적으로 높았다 (p<0.05). 대사의 변화를 추정하기 위해서 AUC대사체/AUCAPAP 를 계산한 결과, pseudo germ-free 군에서 AUCAPAP-Sulfate/AUCAPAP 이 정상 대조군에 비해 유의성 있게 낮은 수치를 보였다 (p<0.01). 이러한 결과들은 APAP 및 이의 6가지 대사체들의 약물동태학적 특성이 장내 미생물의 존재여부에 따라 달라질 수 있다는 것을 말하고 있다. 본 연구를 통해 장내 미생물이 약물과 같은 생체 이물의 대사에 중요한 역할을 하고 있음을 확인할 수 있었다. 따라서, 현재까지는 간이 대부분의 약물의 대사를 담당하는 기관으로 알려져 있으나, 앞으로는 약물의 대사에 있어서 장내 미생물 또한 중요한 역할을 할 수 있음이 인지되어야 할 것으로 사료된다.