Bone phenotypes of constitutive androstane receptor null mice

Abstract

Backgrounds Constitutive androstane receptor (CAR) was originally identified as xenobiotic sensor that regulates the expression of cytochrome P450 genes. However, recent results suggest that this nuclear receptor also has more diverse roles in endobiotic homeostasis. Furthermore, extensive crosstalks with many nuclear receptors including vitamin D receptor, estrogen receptor, glucocorticoid receotor, and peroxisome proliferator-activated receptor, strongly suggested possible role in the bone mass regulation. However, it has not been investigated the role and mechanism of CAR in bone metabolism in vivo. This study investigated the physiological role of CAR in bone metabolism. Materials and methods we analyzed the bone phenotypes of CAR null (CAR-/-) mice using in vivo morphological analyses and ex vivo cell culture systems. Results Endogenous CAR-/- mRNA expressions were observed during osteoblast and osteoclast differentiation. Primary culture of calvarial cells exhibited no significant changes in ALP activities as well as bone nodule formation assessed by Alizarin Red staining between CAR-/- and WT. Bone marrow macrophage (BMM) culture in the presence of receptor activator of NF-κB ligand (RANKL) showed that tartrate-resistant acid phosphatase positive multinuclear cell formation was significantly increased in BMMs from CAR-/- mice compared to those from WT littermates. Male CAR-/- mice has resulted in significant increase in whole body bone mineral density (BMD) by 9.5% (p < 0.001) in male at 10 weeks of age compared with WT littermates, which was maintained up to 15 weeks of age. Furthermore, micro-CT analysis of proximal tibia at 10 weeks of age demonstrated significant increase in trabecular bone volume (62.7%), trabecular number (54.1%) in male CAR-/- mice compared with WT mice. However, these findings were not observed in female mice. The mRNA expressions of Cyp2b9 and 2b10 in the liver, which regulate testosterone metabolism, were significantly down-regulated while serum testosterone levels showed 2.5-fold increase in male CAR-/- mice at 10 weeks of age. The difference in BMD between CAR-/- and WT mice disappeared at 8 weeks after performing orchiectomy. Conclusions These results suggest that in vivo deletion of CAR resulted in greater bone mass, which appears to be a result from reduced metabolism of testosterone due to suppressed Cyp2b expression. ;Constitutive androstane receptor (CAR)는 스테로이드 호르몬과 비타민 D를 비롯한 다양한 xenobiotics을 리간드로 하며 그들의 대사에 관여하는 핵수용체이다. CAR 유전자 결핍 마우스는 약물 및 외부 독성에 대한 감수성에 이상이 보임이 알려져 있으나 골대사에 미치는 영향은 연구된 바 없다. 본 연구에서는 CAR 유전자결핍 (-/-) 마우스의 골표현형에 대해 분석하였다. DXA를 이용한 골밀도 분석에서 5주령의 CAR-/- 마우스는 wild-type (WT)마우스와 비교시 암, 수 모두에서 골밀도의 차이를 보이지 않았지만, 10주령 male CAR-/- 마우스의 경우 골밀도의 유의한 증가를 보였으며 장골의 microCT분석에서도 유의한 소주골량의 증가를 보였다. 10주령 female CAR-/- 마우스는 골량의 차이를 보이지 않았다. CAR-/- 마우스에서 CAR의 주요 목표유전자이고 testosterone의 대사를 조절하는 Cyp2b9와 Cyp2b10의 mRNA 발현이 유의하게 감소되어 있었으며 male CAR-/- 마우스에서 유의한 혈중 testosterone증가를 관찰하였다. 또한 CAR-/-와 WT 사이의 골밀도 차이는 고환절제술을 시행한 결과 수술 후 8주에 그 차이가 소실되었다. 10주령 CAR-/- 마우스는 혈중 내 1,25(OH)2vitaminD3 증가를 보였으며 이는 암컷과 수컷 마우스 모두에서 관찰되었다. 1,25(OH)2vitaminD3 비활성화를 유도하는 Cyp24 mRNA 발현이 CAR-/-에서 감소된 경향을 보였으나 통계적으로 유의하지 않았으며 활성형 vitamin D를 유도하는 Cyp27B1 mRNA은 CAR-/-에서 유의하게 발현이 감소됨이 관찰되었다. 마우스 두개골로부터 분리한 조골세포의 분화과정에서 알칼리성 인산분해효소 활성도와 Alizarin Red 염색을 통해 평가한 골석회화는 양군간에 차이가 없었다. 그러나 마우스의 골수대식세포에 receptor activator of NF-κB ligand (RANKL)를 처리하여 파골세포로 분화시 CAR-/- 마우스에서 TRAP양성인 다핵 파골세포의 수가 유의하게 증가되어 있음을 확인하였다. 결론적으로 CAR-/- 마우스는 male의 경우 WT 마우스에 비하여 골량이 증가되어 있는 데, 이는 Cyp2b 발현 감소에 의한 testosterone대사의 감소에 의한 것으로 생각된다. 본 연구 결과는 CAR가 cytochrome P450 system 조절을 통해 androgen과 비타민 D의 생체 내 대사의 조절에 관여함을 시사한다.