STAT-3 regulates oncostatin M induced adrenomedullin expression in glioblastoma

Abstract

Adrenomedullin (AM)은 calcitonin gene-related peptide (CGRP)와 유사한 구조를 가진 분화다능 펩타이드로, 심장혈관과 신장 장애, 패혈증, 염증, 당뇨병, 암과 같은 여러 가지 병을 매개하는 것으로 알려져 있다. AM은 세포증식, 혈관형성 기능을 하고 분자적•생리학적 특성에 의해 악성 세포를 악화시키는 기능이 있음이 보고되었다. 최근까지의 연구결과를 통해 암세포에서 AM이 증가되어 있다는 점과 Signal transducer and activator of transcription-3 (STAT-3)의 발현이 증가된 것이 보고되었으며, 이들을 통해 세포고사가 보고되어왔다. 그러나 AM과 STAT-3가 직접적으로 관련이 있다는 보고가 아직 없어, 이 두 분자가 교모세포종에 미치는 영향에 대해 알아보고자 하였다. 본 연구에서는 교모세포종에 Oncostatin M (OSM) 처리에 의한 자극을 주었을 때의 변화를 관찰하였다. CRT-MG, U87-MG, U251-MG와 같은 사람 교모세포종에 OSM을 처리하여 역전사효소중합연쇄반응 (RT-PCR)을 수행한 결과 OSM receptor인 OSMR, gp130의 mRNA가 발현하고 있는 것을 확인하였고 또한 immunoblotting을 수행한 결과STAT-3의 인산화가 유도되는 것을 관찰할 수 있었다. 그리고 AM promoter에 아직 알려지지 않은 STAT-3 DNA 결합 부위를 찾고 이에 해당하는oligonucleotide를 이용한 Electrophoretic mobility shift assays (EMSA)를 수행하였다. 그 결과 OSM을 처리하지 않은 대조군에 비해 OSM를 처리하였을 때 AM promoter에 존재하는STAT-3 DNA 결합 부위에 STAT-3의 결합이 증가하는 것을 보였으며, 이러한 결과로부터 OSM이 STAT-3의 신호전달과정을 유도하고 AM유전자 발현을 촉진한 것으로 추측할 수 있다. 또한, AM의 발현이 OSM에 의해 유도 되는지 관찰하기 위해 역전사효소중합연쇄반응 (RT-PCR)을 수행하였고, 실험 결과 AM mRNA의 발현이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 AM이 세포교모종에 미치는 역할을 확인하기 위하여 AM receptor가 많이 발현되어 있는 세포교모종 중에 하나인 CRT-MG세포에AM1-52와 AM 22-52 를 처리하여 scratch assay를 수행하였다. 그 결과 AM 22-52 와 비교하였을 때 AM1-52를 처리한 군에서 세포 이동이 더 증가한 것을 볼 수 있었다. 이러한 연구 결과를 통해 교모세포종은 OSM cytokine 자극에 의해 세포 내로 신호를 전달하고 STAT-3의 인산화를 유도한다. 활성화된 STAT-3는 핵 속으로 이동하고 핵 속에 있는AM promoter 와 결합하여AM의 발현을 증가시키며, 분비된 AM은 세포막에 존재하는 AM receptor를 통해 세포 이동에 영향을 주는 것을 알 수 있다. 본 연구 결과를 통해 교모세포종에서의 AM발현을 조절하는STAT-3의 작용기전 및 AM과 STAT-3 관계를 밝혔으며, 이러한 연구결과는 교모세포종의 악성화 및 전이과정에 대한 이해를 넓히는데 기여할 수 있을 것으로 사료된다.;Adrenomedullin (AM) is a secreted peptide hormone with multiple functions to mediate a variety of diseases such as sepsis, inflammation, diabetes and cancer. AM plays as a cell proliferation- and angiogenesis-inducing factor. Several reports have been identified that both AM and Signal Transducer and Activator of Transcription-3 (STAT-3) are upregulated in a variety of human cancers, including brain, breast, colon, prostate and lung cancers. It has also been reported that AM and STAT-3 respectively suppressed apoptosis in cancer. However, the direct relationship between STAT-3 and AM has not been fully understood. To test whether AM expression is affected by STAT-3 activity in glioblastoma, CRT-MG, U87-MG and U251-MG were treated with oncostatin M (OSM), strong inducer of STAT-3 activation. Immunoblotting showed the enhanced STAT-3 phosphorylation in OSM-treated glioblastoma cells. In the presence of OSM, STAT-3 binding to AM promoter was enhanced and the expression level of AM was also increased in glioblastoma cells. To address the effect of AM on glioblastoma, CRT-MG cells were treated with AM peptide, full length AM1-52 or truncated peptide AM22-52. In scratch assay, glioblastoma cell migration was significantly enhanced by AM1-52 and was modestly increased by AM22-52. Taken together, OSM induced STAT-3 phosphorylation and activation in glioblastoma cells, which leads to enhanced DNA binding of STAT-3 to AM promoter and induction of mRNA expression of AM. In this study, OSM induces AM expression through STAT-3 activity in glioblastoma cells indicating that STAT-3 regulates AM expression in glioblastoma and contributes to tumor metastasis through AM. These data suggest that STAT-3 is an important regulator of AM in glioblastoma, and support the notion of using STAT-3 or AM as a therapeutic target in the future.