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Characterization of PHRF1, a novel SR-like CTD-associated protein

Title
Characterization of PHRF1, a novel SR-like CTD-associated protein
Authors
박지혜
Issue Date
2012
Department/Major
대학원 생명·약학부생명과학전공
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Master
Advisors
윤영대
Abstract
Systemic lupus erythematosus, SLE, is an autoimmune inflammatory disease characterized by antinuclear autoantibodies, interferon activation and tissue destruction. The susceptibility of SLE disease has shown to be linked with genetic variations. Recently, several genome-wide association studies have shown that KIAA1542 locus contains single nucleotide polymorphism (SNP) in SLE patients. KIAA1542 locus encodes a 1682 amino acid protein, PHRF1, containing a RING domain and a PHD finger, SR-like domain, and CID (RNA polymerase II CTD-interaction domain). However, the functions of PHRF1 remain unknown at this stage. In this study, as an approach to study the functions of PHRF1, I started by determining the subcellular localization of PHRF1. In immunofluorescence assay, PHRF1 is localized in nucleus suggesting that PHRF1 functions in nucleus. On the other hand, PHRF1 contains a PHD domain known to involve in chromatin remodeling. Therefore, I studied the possibility whether PHRF1 binds any of the histones through the PHD domain. Upon coimmunoprecipitation experiment using overexpressed histones and PHRF1 in HEK293T cell line, I found that PHRF1 associated specifically with Histone 2B but not other histones. This finding suggests the possibility that PHRF1 may recognize the modified form of Histone 2B and participate either in chromatin remodeling or transcription. In addition, PHRF1 also contains a CTD interaction domain (CID) which is known to interact with CTD domain of RNA polymerase II during transcription and splicing. Therefore, I studied whether PHRF1 binds CTD domain through CID and found that PHRF1 interacts with the RNA polymerase II. Especially, CID of PHRF1 specifically interacts with Ser2-phosphorylated form of CTD domain of RNA polymerase II. Consistent with this finding, in immunofluorescence assay, PHRF1 colocalized with the transcription sites. PHRF1 location detected by anti-Myc antibody exactly overlapped with the BrUTP in corporation site detected by anti-BrdU antibody. Taken together these results suggest that PHRF1 may interact with the RNA polymerase II and localize to transcription site and thereby participate in pre-mRNA processing. Furthermore, to find binding partners of PHRF1, yeast two-hybrid screening of 3.4 X 106 independent clones of human peripheral lymphocytes cDNA library was performed using PHRF1 as bait. As a result, a total 110 of positives were obtained and 93 of them were rescued and sequenced. Among positives, IFP35 (IFN induced protein35), NMI (N-myc interactor) and LMO2 (LIMdomain only2) each were presented 4 times. RNA-binding protein EWS and SLM2 (KH domain-containing, RNA binding, signal transduction-associated protein 3) were presented 3 times. Zinc finger protein ZFAT was represented twice. Currently, the association of PHRF1 with the potential binding partners is being investigated in mammalian cells. ;SLE(Systemic lupus erythematosus) 는 항핵항체, 활성화된 IFN 그리고 조직파괴 등으로 알려진 자가면역질환이다. SLE 질병의 감수성은 유전적 변이와 관련된 것으로 알려졌다. 최근 진행된 몇몇 GWAS연구들은 SLE 환자 군의 KIAA1542 유전자 자리에서 단일염기변이를 발견하였다. KIAA1542유전자는 PHD finger, RING domain, SR-like domain, 그리고 CTD interaction domain을 가지는 PHRF1 단백질로 발현된다. 그러나 PHRF1의 기능은 아직까지 알려지지 않았다. 여기서는, PHRF1의 기능을 알아보기 위하여 먼저 PHRF1의 세포 내 위치를 확인하였다. Immunofluorescence assay를 통해 PHRF1이 핵에 위치하는 것을 확인했고, 이는 PHRF1이 핵 내에서 기능을 한다고 예상할 수 있다. 다른 한편으로, PHD finger가 histone에 결합함으로써 chromatin remodeling 과정에 관련되어 있다고 알려져 있으므로, PHRF1이 PHD finger을 통해 어떤 histone과 결합하는지 확인했다. HEK293T 세포에서 과발현시킨 Histone 2B와 PHRF1을 이용해 immunoprecipitation을 시행한 결과, PHRF1과 Histone 2B가 결합하는 것을 확인하였다. 이 발견으로 PHRF1이 Histone 2B의 modified form을 인식하고 chromatin remodeling이나 transcription과정에 참여할 가능성을 예상할 수 있다. 그 다음으로 PHRF1이 transcription과 splicing 과정 중 RNA polymerase II의 CTD domain과 결합하는 것으로 알려진 CTD interaction domain을 가지고 있으므로, PHRF1이 CID domain을 통해 RNA polymerase II의 CTD domain과 결합하는 지 확인했다. 그 결과, PHRF1의 CID domain은 RNA polymerase II의 CTD domain의 Ser2-phosphorylated form과 특이적으로 결합하였다. 위의 결과와 일치되게, immunofluorescence assay에서, PHRF1이 transcription 위치와 같이 위치하고 있는 것을 확인했다. 이 결과들을 종합해보면 PHRF1이 RNA polymerase II와 결합하고 transcription 위치에 존재함으로써 pre-mRNA processing에 참여할 것이라 예상할 수 있다. 또한 PHRF1과 결합하는 단백질을 찾기 위해 PHRF1을 bait로 사용하고 3.4 X 106 의 독립적인 colon들을 포함한 human peripheral 림프구 library를 이용하여 yeast two-hybrid screening을 시행하였다. 그 결과, 전체 110개의 positives를 얻었고, 그 중 93개의 클론들을 rescue한 후 sequencing 하였다. Positives중에서, IFN induced protein35 (IFP35)와 N-myc interactor (NMI)는 각각 네 번씩 결과를 얻었다. RNA-binding protein EWS는 세 번의 결과를 얻었고, LIM domain only2 (LMO2), SLM-2 (zinc finger protein ZFAT과 KH domain-containing, RNA binding, signal transduction-associated 3)는 각각 두 번씩의 결과를 얻었다. 이번 연구에서 밝혀진 잠재적인 결합 파트너와 PHRF1이 mammalian 세포에서 실제로 결합하는지 현재 확인 중에 있다.
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