Novel Intracellular Protein Delivery Carriers Based on pH-Responsive Mesoporous Nanoparticles

Abstract

본 논문에서는 세포 불투과성이며 질병치료 기능을 갖는 단백질의 효율적인 세포 내 전달을 위해 지능형 메조다공성 나노입자를 합성하였으며, 메조기공 표면에pH에 감응하여 음전하에서 양전하로 바뀌는 특성을 부여하여 세포 내 endosome (pH ~ 5.0) 에서 효율적인 단백질 방출을 통해 메조다공성 나노입자가 암조직 치료에 적용 가능할 것인가에 대해 연구하였다. 메조다공성 나노입자는 CTAB 유기 템플레이트 및 TEOS 무기 전구체 기반 합성 기법을 사용해 제조하였으며, FE-SEM 및 TEM으로 분석한 결과 250 nm의 평균 입자크기 및 5.4 nm의 메조기공을 갖는 나노입자가 합성되었음을 확인하였다. 메조기공의 표면기능화를 통해 pH 변화에 반응하여 가수분해되어 음전하에서 양전하로 변환 가능한 citraconic amide를 도입하였다. Citraconic amide가 도입된 메조다공성 나노입자 (MSN-Cit)는 solid-state NMR, FT-IR spectroscopy와 BET 분석으로 기공표면의 기능화를 확인하였다. Zeta potential 측정을 통해 pH 7.4에서 endosome pH 인 pH 5.0인 환경으로 바뀜에 따라 MSN-cit의 표면전하가 citraconic amide의 가수분해에 의해 음이온에서 양이온으로 변환됨을 확인하였다. 메조다공성 나노입자의 암세포 치료용 세포 내 전달체로서의 기능확인을 위해 양전하인 세포 불투과성 cytochrome c (Cyt c)를 메조기공 내에 봉입하였다. 양이온성 Cyt c는 MSN-Cit의 음이온성 기공에 이온결합을 통해 봉입됨을 확인하였다. 본 연구에서 고안된 메조다공성 실리카 나노입자 (MSN-Cit)는 생리적 pH (pH 7.4) 에서는 양이온성의 단백질을 방출을 효과적으로 지연시켰으며 endosomal pH (pH 5.0)에서는 단백질의 방출을 용이하게 하였다. 자궁경부암 HeLa 세포를 이용한 in vitro 암세포 성장억제 실험을 통해, citraconic amide가 도입된 MSN-Cit가 세포 불투과성인 Cyt c의 성공적인 세포 내 전달을 유도함을 확인하였다. Cyt c 자체로는 세포 내부에 투과되지 않으므로 암세포의 성장을 억제시키지 못하였으며, citraconic amide가 기공표면에 도입되지 않은 대조군 메조다공성 나노입자는 endosome 내에서 단백질 방출 유도 기능이 결여되어 있으므로 MSN-Cit에 비교해 낮은 암세포 억제기능을 보였다. 따라서, MSN-Cit의 세포 내 단백질 전달효율 및 암세포 억제 기능이 탁월함을 확인할 수 있었다. 본 연구에서 개발한 지능형 메조다공성 나노입자는 세포 불투과성으로 인해 적용이 불가능한 다양한 치료용 단백질의 효율적인 세포 내 전달에 사용할 수 있으므로 폭 넓은 응용가능성을 갖는 나노전달체로서의 역할이 기대된다.;A smart mesoporous silica nanoparticle (MSN) with a pore surface was developed to undergo charge conversion in intracellular endosomal condition. The surface of mesopores in the silica nanoparticles was engineered to have pH-hydrolyzable citraconic amide. Solid state nuclear magnetic resonance (NMR), Fourier-transform infrared (FT-IR) spectroscopy, and Brunauer–Emmett–Teller (BET) analyses confirmed the successful modification of the pore surfaces. MSNs (MSN-Cit) with citraconic amide functionality on the pore surfaces exhibited negative zeta potential (-10 mV) at pH 7.4 because of the presence of carboxylate end groups. At cellular endosomal pH (~5.0), MSN-Cit have a positive zeta potential (16 mV) indicating the dramatic charge conversion from negative to positive by hydrolysis of surface citraconic amide. Cytochrome c (Cyt c) of positive charges could be incorporated into the pores of MSN-Cit by electrostatic interactions. The release of Cyt c can be controlled by adjusting the pH of the release media. At pH 7.4, the Cyt c release was retarded, whereas, at pH 5.0, MSN-Cit facilitated the release of Cyt c. The released Cyt c maintained the enzymatic activity of native Cyt c. Hemolytic activity of MSN-Cit over red blood cells (RBCs) was more pronounced at pH 5.0 than pH 7.0, indicating the capability of intracellular endosomal escape of MSN carriers. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) studies showed that MSN-Cit effectively released Cyt c at endosomal compartments after uptake by cancer cells. MTT assay showed that Cyt c alone exhibited negligible cytotoxicity, which can be ascribed to its cell-impermeable nature. Although the control Cyt c-loaded MSNs such as MSN-Cyt c and MSN-Suc-Cyt c showed the dose-dependent cytotoxicity, it is noteworthy that MSN-Cit-Cyt c showed the higher cell toxicity than MSN-Cyt c and MSN-Suc-Cyt c. The MSN developed in this work may serve as efficient intracellular carriers of many cell-impermeable therapeutic proteins.