Functional characterization of Hes1 WRPW domain in degradation and protein-protein interaction

Abstract

Hes1 is known to oscillate in neural stem cells, neuroepithelial cells and glial cells. This oscillation is important in maintaining stem cell properties and blocks the cell from differentiating to neuronal precursor cells. For Hes1 protein to oscillate, it needs to be translated and degraded constantly and these processes must be regulated tightly. Here, we focused on Hes1 degradation and the aim of this study is to find the characteristics of WRPW domain of Hes1 and its effects on Hes1 degradation. We made two types of mutants for every experiment; one without WRPW and following RN residues (ΔWRPW) and another with WRPW but without RN residues (ΔRN). We found that WRPW deletion (ΔWRPW) in Hes1 does reduce degradation of Hes1 protein in HEK293T cells and that RN residues also promote degradation but to smaller degree than ΔWRPW. By using pull-down assay, we found that WRPW domain is essential for TLE1-binding. However WRPWRN peptide alone is not sufficient for this association. It also shows that having RN residues behind WRPW tetrapeptide (wild type) promotes a stronger binding of TLE1 to Hes1 than when RN residues were not present (ΔRN). As a result, WRPW peptide alone is not sufficient for protein-protein interaction and it needs Orange domain to induce protein-protein interaction. Several proteins were found to interact with Hes1 Orange domain, but not necessarily in the presence of WRPW domain.;Hes1 단백질은 신경상피세포 (neuroepithelial cell), 방사신경아교세포 (radial glial cell)와 같은 신경줄기 세포에서 일정한 주기로 진동한다. 이러한 진동은 줄기 세포의 성질을 유지하는 데에 중요한 역할을 하며, 줄기 세포가 신경세포로 분화하는 것을 막아준다. Hes1 단백질이 이러한 진동을 보여주기 위해서는 Hes1이 주기적으로 번역되고 분해되어야 한다. 그리고 이러한 과정은 긴밀하게 조절되어야 한다. 이 논문에서 우리는 Hes1이 분해되는 과정에 주목하였고, Hes1 WRPW domain의 특성이 Hes1 분해에 영향을 미칠 것이라고 가정하여 연구를 진행하였다. 여기에서 진행된 모든 실험에는 두 가지 돌연변이를 만들어 사용하였다; WRPW와 그 뒤의 RN 잔기(residues)가 없는 돌연변이 (ΔWRPW)와 WRPW domain은 있지만 RN 잔기가 없는 돌연변이 (ΔRN)를 만들었다. 우리는 Hes1에서 WRPW domain이 부재 시 (ΔWRPW), HEK293T 세포에서 Hes1 분해가 감소되는 것을 보았으며, RN이 없는 경우 (ΔRN) 또한 Hes1 분해가 감소되었으나, 그 영향은 ΔWRPW 보다는 적다는 것을 보았다. Pull-down assay를 통해 WRPW domain이 TLE1 단백질과의 결합에 필수적이라는 것을 알 수 있었다. 그러나 WRPW domain은 독자적으로 이러한 TLE1와의 결합을 매개하기에는 충분하지 않다는 것을 알 수 있었으며, WRPW domain 뒤의 RN 잔기가 TLE1와의 결합을 더 강하게 유지시켜주는 역할을 한다는 것을 알 수 있었다. 결과적으로 WRPW domain 자체만으로는 단백질간의 결합을 유도할 수 없으며, WRPW domain은 단백질간의 결합을 위해 Orange domain을 필요로 한다는 것을 알 수 있었다. Hes1의 Orange domain에 여러 개의 단백질이 결합한다는 것을 볼 수 있었으나, WRPW domain을 필수적으로 요하지는 않았다.