Investigation of Structural Integrity of PLGA During Ammonolysis-based Microencapsulation Process

Abstract

The objectives of this study were to evaluate the structural integrity of PLGA during an ammonolysis-based microencapsulation process used to prepare microspheres. PLGA (0.25 g; i.v. = 0.25 dL/g or 0.58 dL/g) microspheres were prepared using organic solvents (ethyl acetate or isopropyl formate; 3 to 6 mL). Microsphere hardening was achieved by treating oil-in-water emulsions with an ammonia solution. Three levels of the two factors (solvent volume and ammonia concentration) were selected to design a full factorial design. Total 108 batches of microspheres were prepared in a random manner. First of all, a separate GC experiment was carried out to compare the rates of ammonolysis observed with ethyl acetate and isopropyl formate. GC analysis showed that ammonolysis of isopropyl formate took place rapidly, whereas ethyl acetate displayed a poor reactivity toward ammonolysis. After microsphere preparation, PLGA Mw and its lactide:glycolide ratio were characterized by GPC and 1H NMR experiments. ANOVA, interaction effect analysis, and various model adequacy tests were also carried out using a statistical program. The Mw and lactide:glycolide ratio of PLGA raw polymer (i.v. = 0.25 dL/g) were measured to be 25,925 ± 671 g/mol and, 75.03:24.97 respectively. When 3 mL of isopropyl formate was reacted with an equimolar amount of ammonia, the Mw and lactide:glycolide ratio of the polymer remained unchanged after microencapsulation. However, when isopropyl formate was substituted with ethyl acetate, the glycolide proportion of the polymer was decreased to 23.36 ± 0.34%. At the same time, its Mw was reduced to 20,660 ± 295. When ammonolysis was performed at organic solvent:ammonia molar ratios of 1:2 and 1:3, further reductions in the glycolide proportion and Mw of the polymer occurred. For example, when microencapsulation was processed at an ethyl acetate:ammonia molar ratio of 1:3, the glycolide proportion and Mw of the resultant microspheres were 20.79 ± 0.26% and 14,171 ± 378, respectively. Increasing the volume of the organic solvents to 6 mL exasperated PLGA degradation. Another polymer (i.v. = 0.58 dL/g) showed same results. In conclusion, the availability and exposure time of ammonia to ester bonds of PLGA were critically associated with PLGA degradation during the ammonolysis-based microencapsulation process. Optimization of the type of an organic solvent, its volume, and an organic solvent:ammonia molar ratio made it possible to maintain the structural integrity of PLGA.;Ammonolysis 반응에 근거한 microspheres 제조 과정에서, 사용하는 암모니아가 poly-d,l-lactide-co-glycolide (PLGA) 고분자 구조에 어떤 영향을 미치는지를 평가하고자 하였다. Microspheres 제조를 위하여 0.25 g의 PLGA (i.v. = 0.25 dL/g 또는 0.58 dL/g)를 ethyl acetate와 isopropyl formate 3 내지 6 mL에 녹였다. 이 분산상을 0.5% polyvinyl alcohol 수용액 40 mL에 유화시켜 o/w 유제를 형성하였다. Microspheres의 고체화는 생성된 o/w 유제에 암모니아를 가해줌으로써 이루어졌다. Isopropyl formate의 경우 기존의 할로겐화 용매에 비해 안전성이 뛰어나고 암모니아와 빠르게 반응하여 가용성인 isopropyl alcohol과 formamide로 변하는 특성을 가지고 있기 때문에 ammonolysis 반응을 이용한 microspheres 제조 과정에 활용할 수 있었다. 또한 현재 microspheres 제조에 널리 쓰이는 ethyl acetate 역시 분산 용매로 선택하였다. GC 실험 결과를 토대로 ammonolysis에 대한 ethyl acetate 및 isopropyl formate의 반응속도 차이를 비교할 수 있었다. Isopropyl formate는 암모니아와 빠른 속도로 반응하여 분해되었지만 ethyl acetate는 낮은 ammonolysis 반응속도를 보였다. 이러한 반응성의 차이는 PLGA 고분자의 분해에도 영향을 미칠 것으로 판단 되었다. 이를 증명하기 위하여 GPC와 1H NMR을 통해 제조한 고분자의 분자량 및 lactide:glycolide 비율을 분석하였다. 보다 체계적인 분석을 위하여 통계 프로그램의 ANOVA 시험과 상호작용 효과 분석, 그리고 모델 적합성 시험을 사용하였다. 분석 결과, PLGA raw polymer의 분자량 및 lactide:glycolide 비율은 각각 25,925 ± 671 g/mol과 75.03:24.97으로 측정되었다. 3 mL의 isopropyl formate를 당량의 암모니아와 반응시켰을 때 PLGA 분자량과 lactide:glycolide 비율은 microencapsulation 후에도 변함이 없는 것으로 나타났다. 하지만 isopropyl formate를 ethyl acetate로 바꾸어 실험하자 PLGA 분자량이 20,660 ± 295 g/mol로 줄어들었으며, glycolide 부분의 비율 또한 23.36 ± 0.34%로 감소한 결과를 보였다 (p<0.05). 특히 유기용매:암모니아의 몰 비를 1:2 그리고 1:3으로 증가시켜 ammonolysis 반응시켰을 때 PLGA 분자량 및 glycolide 비율은 더욱 큰 폭으로 감소하였다. 한 예로, ethyl acetate:암모니아의 비율을 1:3으로 하여 microspheres를 제조하였을 경우 PLGA 분자량은 14,1711 ± 378 g/mol이었으며 glycolide 비율은 20.79 ± 0.26%이었다. 다른 분자량의 PLGA 고분자 (i.v. = 0.58 dL/g)를 가지고 동일하게 실험하였을 때에도 유사한 결과를 관측할 수 있었다. 이러한 결과를 볼 때, PLGA ester bond에 대한 암모니아의 접근 용이성 및 접촉 시간은 ammonolysis 반응에 근거한 microencapsulation 과정에서 PLGA 분해에 중요한 영향을 미친다는 사실을 알 수 있다. 따라서 유기용매의 종류 및 부피, 그리고 유기용매:암모니아의 몰 비를 최적화한다면, PLGA 분자량 및 조성에 영향을 주지 않고 microspheres를 제조할 수 있을 것으로 결론지을 수 있었다. Ammonolysis 반응을 이용한 microspheres 제조법을 기반으로 하여 효과적인 약물의 전달이 가능한 새로운 기술이 연구될 수 있을 것으로 기대한다.