Daphnane diterpenoid계 물질의 gefitinib 내성 사람 폐암 세포에서의 내성 극복과 세포성장 증식 억제 작용기전 연구

Abstract

전 세계적으로 암 발생률 및 사망률은 꾸준히 증가하는 추세에 있어 효과적인 항암제 개발의 중요성 또한 증가하고 있다. 항암제 시장은 심혈관계, 신경계 질환과 더불어 세계에서 세 번째로 시장규모가 크며, 세계적으로 2000 년도에 약 1 천만 명이 암 환자로 판명되었으며, 2020 년에는 약 1 천 5 백만 명에 이를 것으로 추정되고 있다. 시장 규모는 2003 년도에 35 조원으로 추정되며 2010 년에는 60 조원에 이른 것으로 예상되는데, 이러한 조사 결과는 항암제 개발을 위한 연구가 전 세계적으로 활발히 이루어지고 있음을 반증하는 것이다. 특히 천연물은 예로부터 질병 치료를 위한 수단으로서 널리 이용되어 왔으며 현재까지도 새로운 치료제 개발을 위한 중요한 원천이다. 1981 년부터 2002 년까지 개발된 신약 중 천연물에서 유래하였거나 천연물 유래 물질을 바탕으로 합성된 화합물은 전체의 52%로 나타났으며, 1940 년대에서 2002 년까지 개발된 항암제 중 천연물로부터 확보되었거나 천연물 유래 물질을 기반으로 합성된 화합물은 전체의 60%로 나타나 천연물이 의약품, 특히 항암제 개발을 위한 자원으로서 중요한 역할을 차지하고 있음을 알 수 있다. 현재 임상에서 많이 사용되고 있는 paclitaxel, vinblastine, vincristine 등은 모두 천연물로부터 분리된 항암 효능 물질이다. 통계청 자료에 의하면 폐암은 국내에서 암 사망률 제 1위의 질환이며 최근 10 년 동안 다른 암에 비하여 증가속도가 가장 빠르며 앞으로도 폐암 발생 및 사망률은 지속적으로 증가하여 20 ~ 30 년 후에는 현재의 두 배 이상까지 증가될 것이라 추정된다. 폐암에 대한 치료는 크게 수술법, 방사선 치료법, 항암화학 치료법 등으로 구분할 수 있으나 대부분의 경우 항암화학 약물을 추가로 투여 함으로서 더 높은 치료 효과를 얻고 있고 진행성 폐암에서는 항암화학요법 또는 방사선치료가 주된 치료이다. 지난 10 년간, 백금 화합물과 vinorelbine, gemcitabine, taxane계와 같은 새로운 항암제의 병용투여에 의하여 삶의 질과 생존율은 크게 증가하였다. 그럼에도 불구, 진행성 비소세포폐암의 1 년 생존율은 35%, 2 년 생존 률 은 15 ~ 20% 밖에 되지 않으며 폐암은 현재 치료법으로 치료한계점에 도달하였다. 최근 특정한 생물학적 기전을 억제하여 치료효과의 상승 및 부작용을 감소시키고자 하는 새로운 개념의 치료법인 분자표적치료 (Molecular targeted therapy)가 개발되었다. 또한 많은 약제들이 폐암치료를 위한 임상 시험 중에 있다. 그 중 gefitinib (IressaⓇ)과 같은 일부 약제는 비소세포폐암에서 분자표적치료제로서 가장 먼저 미국 식품 의약 청에서 승인을 받아 이미 임상에 적용되어 환자들에게 도움을 주고 있다. 그러나 암은 매우 복잡한 경로로 발전하기 때문에 특정 표적인자만을 선택적으로 억제하는 이러한 분자표적치료제는 장기 투여에 의한 내성이 생기는 문제점이 있으며 특정 유전자의 돌연변이 상태에 따라 선택적인 치료효과를 나타내는 단점이 있기 때문에 이러한 문제점을 극복할 수 있는 항암제 개발이 절실히 요구되고 있다. 최근에는 더 많은 경로를 동시에 차단하는 새로운 다중표적항암제 (Multi targeted anticancer agents) 개발이 다양하게 이루어지고 있다. 특히, 핵심적인 발암 경로의 차단과 암세포의 신생혈관생성을 동시에 차단하여 기존 항암제에 실패한 암환자에서도 우수한 효능을 갖고 부작용을 줄일 수 있는 다중표적항암제 개발이 활발히 진행되고 있다. 약용 식물로 이용되어 왔던 원화 (Daphne genkwa)로부터 본 실험실에서 분리된 daphnane diterpenoids계의 물질이 폐암 세포에 우수한 선택적 항암효과를 지님을 발견하였고 (Chem Pharm Bull 2010) 이에 따라 본 연구에서는 원화 (flowers of Daphne genkwa)에서 분리된 daphnane diterpenoid인 yuanhuadine (YD)과 yuanhuacine (YC)의 사람 폐암 세포 성장 억제 효과 및 그 작용기전에 대해 실험을 수행하였다. 그리고 실제 임상과 유사한 in vitro 및 in vivo 실험모델을 적용하여 기존 항암제인 gefitinib에 내성을 갖는 사람 폐암 세포 주 H292 (H292-Gef)에 대한 대상 물질의 성장 억제 효능 및 gefitinib과의 병용처리에 따른 사람 폐암 세포 주 A549에 대한 암세포 성장 저해 활성도 살펴보았다. cDNA microarray를 통하여 모세포 (H292)와 구별되는 내성세포 주 (H292-Gef)에서의 유전자 발현을 알아보았으며, 그 중 발현이 특징적으로 구별되는 유전자 NNMT, SERPINB2와 LAMB3를 선택하여 real-time PCR와 western blot analysis을 이용하여 microarray의 결과를 검증하였다. 이러한 연구는 새로운 기전을 가지는 천연물 유래 물질의 선택적 항암 효능을 밝힘 으로 서 폐암, 특히 기존 항암제인 gefitinib에 내성을 가지는 폐암을 치료하기 위한 신약의 개발에 있어 다양한 자원을 확보할 수 있다는 점에서 가치가 있다. 또한 작용기전 연구를 통하여 연구 대상 물질에 의하여 발현 및 활성화가 조절되는 세포 신호 전달 체계, 유전자 및 단백질을 규명함으로써 이후 다른 항암 효능 물질 개발을 위한 표적 (target)으로도 적용될 수 있을 것이라 기대한다.;Lung cancer is the leading cause of cancer death throughout the world. Epidermal growth factor receptor (EGFR) is overexpressed in the majority of non–small cell lung cancers (NSCLC) and is a major target for new therapies. In 2005, the EGFR tyrosine kinase inhibitor (TKI) gefitinib (ZD1839, Iressa) received The United States Food and Drug Administration approval as single-agent therapy for the treatment of NSCLC following chemotherapy failure. Gefitinib has shown potent anti-tumor effects and improved symptoms and quality-of-life of a small fraction of patients (9-26%) with advanced-stage NSCLC whose tumors harbor activating mutations in EGFR. However, most of the patients frequently acquired drug resistance. This underlines the critical importance of exploring the molecular mechanisms involved in the drug resistance of cancer cells for improving current treatments in the clinic. In a continuous effort to identify and characterize antitumor agents from natural products we daphnane-type diterpenoids including yuanhuadine from the flower of Daphne genkwa (Thymelaceae) with a potential anti-proliferative activity against human lung cancer cells were recently isolated. Further study was designed to evaluate the effect of daphnane diterpenoids on the growth of gefitinib-resistant human lung cancer H292 cells (H292-Gef). Flow cytometric analysis revealed that yuanhuadine (1 nM) induced cell cycle arrest at G0/G1 phase in H292-Gef cells as well as H292 cells. When compared with the parent H292 cells, the H292-Gef cells demonstrated increased phosphorylation of epidermal growth factor receptor (EGFR) (Tyr 1068), Akt (Ser 473), mammalian target of rapamycin (mTOR)(Ser 2448), extracellular regulated kinase (ERK) 1/2 and Src (Tyr 416). However, yuanhuadine inhibited phosphorylation of signal transducers and activators of transcription 3 (STAT3) and Src in H292-Gef cells as well as H292 cells. In addition, yuanhuadine inhibited the mammalian target of rapamycin (mTOR) which is downstream molecule of Akt, indicating that the cancer cell growth inhibition by yuanhuadine might be in part mediated by the suppression of Akt/mTOR signaling pathway. Additionally, yuanhuadine inhibited EGFR signaling pathway by suppression of phosphorylation of EGFR (Tyr 1068) and their downstream molecules such as Akt and ERK 1/2. LD50 value of yuanhuadine was 30 ~ 40 mg/kg in female ICR mouse. In vivo xenograft study with H292 and H292-Gef cells suggested that yuanhuadine significantly suppressed the tumor growth without overt toxicity compared to control group. Daphnane-type diterpenoid yuanhuacine exhibited the antitumor activity in human lung cancer cells H1993 xenograft nude mouse model. H1993 cells have characteristics of EGFR and c-Met overexpression. In addition, the growth inhibitory effects of xenograft model human lung cancer A549 cells were shown by oral administration of yuanhuacine. The expression of Ki-67 and EGFR were significantly suppressed by yuanhuadine in tumors of H292 and H292-Gef tumor xenograft model analyzing immunohistochemistry and western blot. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and EGFR protein expression were also significantly suppressed by yuanhuadine in tumors of H292 and H292-Gef tumor xenograft model. To identify genes involved in gefitinib resistance gene expression profiles were compared between H292 and H292-Gef cells by cDNA microarray. Gene expressions which were increased or decreased more than two-fold in H292-Gef cells (as compared with the parent cells) were extracted. A total of 193 genes were selected. Among them, 84 genes were upregulated and 109 genes were downregulated in the H292-Gef cells. To confirm the results of the microarray data, real-time PCR and western blot analysis were carried out. Three differential expression genes, NNMT, SERPINB2 and LAMB3, were examined at the mRNA level. NNMT gene was overexpressed in H292-Gef cells compared to H292 cells. However, the expression level of NNMT gene was suppressed by yuanhuadine in H292-Gef cells. SERPINB2 and LAMB3 genes were downregulated in H292-Gef cells compared to H292 cells. The expression level of SERPINB2 and LAMB3 genes was increased by yuanhuadine in H292-Gef cells. A good correlation between the real-time PCR results and the microarray data was shown. In addition, the expression levels of NNMT, SERPINB2 and LAMB3 proteins were compared in yuanhuadine and gefitinib treatment both in H292 and H292-Gef cells by western blot analysis. In H292-Gef cells, the NNMT expressions were significantly reduced by yuanhuadine, whereas the expressions were increased by gefitinib. In H292-Gef cells, the SERPINB2 and LAMB3 expressions were significantly increased by yuanhuadine, whereas the expressions were reduced or stable by gefitinib. The expression levels of NNMT, SERPINB2 and LAMB3 in protein extracts derived from tumor lesions of H292 and H292-Gef xenograft model were also determined. In vitro and ex vivo western blot analyses confirmed the microarray results. These findings provide that yuanhuadine might be a novel lead candidate for a therapeutic agent against human lung cancer cells, especially drug-resistant human lung cancer cell.