Endosomes targeting Hyper-Endo is a biosensor for H2O2, and active as a peroxidase

Abstract

세포내의 H2O2 수준의 변화를 역동적으로 측정하는 것은 세포 생리학에서 H2O2의 역할을 이해하는 측면에서 중요하게 생각된다. 최근에, 세포내의 H2O2 변화를 탐지∙관찰하기 위해 Hyper라는 probe가 개발되었다. 이 형광 H2O2 센서는 H2O2를 감지할 수 있는 E.coli 단백질인 OxyR의 regulatory domain사이에 circularly permuted yellow fluorescent protein이 삽입되어 만들어진 것이다. 신호전달이 일어나는 중요한 부위에서 H2O2 수준은 NADPH Oxidase (Nox)의 국부적 활성화나 특정한 antioxidant단백질의 비활성화에 의해 역동적으로 바뀌게 된다. 따라서, Hyper를 세포 안의 신호전달 지역으로 목표를 하여 보낸다면, 이러한 국소적 H2O2 수준의 변화를 탐지하는데 쓰일 수 있다. 이 연구에서 우리는 redox-dependent신호전달 에 참여하는 endosomes에 위치한 H2O2를 표적화하는 biosensor를 고안했다. Endosome과 연관된다고 알려져 있는 RhoB domain의 cDNA를 Hyper cDNA의 C-terminus에 옮겨 붙이고, Hyper-Endo라고 명명했다. 이 Hyper-Endo를 사용해서, Cos7 cells과 Rat aortic smooth muscle cells (RASMC)안 에서 endosomes에서의 일시적인 H2O2 증가와 뒤이은 기저수준으로의 회복을 관찰했다. 우리는 또한 Thioredoxin (Trx)에 의해 제공되는 환원 등가물을 이용하여 OxyR이 H2O2를 환원시킬 수 있다는 것을 측정함으로써 Hyper단백질이 peroxidase로 역할 할 수 있다는 것을 보였다. 신호전달 중심지 근처에서의 Hyper 단백질의 과발현은 세포죽음을 유발 시킬 수 있다. 이 연구를 통해 세포 밖으로부터의 생리적 자극 후 신호전달에 관여하는 endosomes에서 H2O2 수준의 변화를 증명했고, 또한 Hyper를 이용하여 신호전달에 중요하며 endosome에 위치한 H2O2를 제거 하는 것은 세포의 생존에 영향을 미친다는 것을 보여주었다.;Dynamic measurement of intracellular H2O2 levels is important for understanding the role of hydrogen peroxide in cell physiology. Recently, Hyper was developed to monitor intracellular levels of H2O2. This genetically encoded fluorescent H2O2 sensor was on the basis of circularly permuted yellow fluorescent protein inserted into the regulatory domain of E. coli protein OxyR, which is prokaryotic H2O2-sensing protein. Because the local H2O2 levels are changed dynamically through local activation of NADPH oxidases and/or specific inactivation of antioxidant proteins in signaling centers, the targetable Hyper to signaling area in the cell can be used to monitor the change of local H2O2 level. Here, we designed a genetically encoded biosensor for H2O2 specifically in endosomes that can participate in redox-dependent signal transduction. We introduced the cDNA encoding RhoB domain which is required to associate with endosomes at the C-terminus of Hyper cDNA to produce pHyper-Endo plasmid. Using Hyper-Endo, we observed a transient increase of H2O2 in endosomes in Cos7 cells and Rat aortic smooth muscle cells (RASMC) and its subsequent recover to basal level. We also show that Hyper protein can act as a peroxidase by assessing that OxyR can reduce H2O2 with the use of reducing equivalents provided by thioredoxin (Trx). Besides, the overexpression of Hyper protein around signaling centers can induce cell death. In this study, we demonstrated dynamics of H2O2 around signaling endosomes in the cell under ligand activations, and the removal of endosomal H2O2 by targeted Hyper affects cell survival.