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dc.description.abstract유방암은 전 세계 여성들에게 발생되는 암이다. 여성 유방암 환자 중 약 30% 정도는 Her2 (human epidermal growth factor receptor 2) 양성 유방암 환자이다. Her2는 인체에서 epidermal growth factor receptor (EGFR : also known as ErbB)의 tyrosine kinases receptor family 중의 하나로 알려져 있다. 지금 FDA에 승인된 Her2를 타깃으로 하는 의약품은 humanized monoclonal antibody인 Herceptin 뿐이다. 하지만 Herceptin은 몇 가지 치료적 개선이 필요하다. 왜냐하면, Herceptin을 복용한 환자에게 치료를 시작한 후 1년 이내에 내성이 보이고, Herceptin 자체의 분자량이 커서 혈액-뇌 관문을 통과하지 못하여 뇌로의 전이 비율이 높게 나타난다. 또한 Herceptin은 Her2 과발현된 상태를 더 이상 Her2의 기능을 잃게 한다. 그러므로 Her2 과발현이 일어나기 전에 transcription level에서 단백질의 양을 조절 할 수 있는 다른 접근방법이 필요하다. 기존의 연구에서는 Her2 단백질이 세포 외부 쪽으로 과량 발현되는 기전 중 하나는 전사 조절 물질(transcription factor)인, ESX (epithelial-specific Ets member 중 하나)가 Her2 promoter에 강하게 결합함으로써 Her2의 과발현을 활성화시킨다는 것이 밝혀져 있다. 이 때 Her2 단백질의 과량생산을 위해서는 ESX가 그것의 coactivator인 Sur2와 결합하는 것이 필요한 것으로 알려져 있다. 그러므로 ESX-Sur2 상호작용의 억제는 Her2의 발현을 down-regulation 할 수 있는 좋은 타깃이 될 수 있다. 즉, ESX와 Sur2의 상호작용을 억제 함으로써 Her2 양성 유방암을 치료할 수 있는 저분자 화합물을 디자인하는데 활용할 수 있을 것이다. ESX와 Sur2의 상호작용을 보다 효과적으로 억제할 수 있는 저분자 유기화합물을 연구 개발함에 있어서는 우선 Sur2의 구조규명이 먼저 이루어져야 한다. Sur2 단백질이 체내와 같은 상태에서 어떠한 구조로 존재하며, 나아가 ESX와 어떤 형태로 결합하는지를 원자적 수준에서 정확히 이해함으로써 Sur2-ESX 상호작용을 효과적으로 방해하는 ESX와 같은 기능을 할 수 있는 저분자 유기화합물을 디자인할 수 있을 것이다. 본 논문에서는 자체적인 분자량이 큰 Sur2 단백질의 NMR 분석이 용이하게 하기 위해 secreted alkaline phosphatase assay을 이용하여 ESX와 결합하는 Sur2의 최소한의 binding core를 결정하였다. 최소한의 binding core인 Sur2391-582를 pET28a vector와 cloning하고, cloning된 pET28a_Sur2391-582는 E.coli에서 isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside를 이용하여 His6-Sur2391-582를 발현시킨 다음 lysis 하였을 때, soluble part로 가는 것을 확인하였다. His6-Sur2391-582는 affinity chromatography와 Superdex 75인 size exclusion 컬럼을 사용하여 FPLC로 분리하였다. 이렇게 분리된 His6-Sur2391-582의 순도는 95% 이상을 얻었다. 이러한 조건을 바탕으로 15N-labeling하여 발현 및 정제하고, two dimensional NMR 실험을 하였다. 또한 15N labeling한 시료는 NMR을 이용하여 ESX와 Sur2의 titration 실험을 하였다. 몇 개의 NMR signal이 moving하는 것을 확인하였고, 그 결과 ESX와 Sur2가 상호작용 한다는 것을 알 수 있었다. 3D (Three dimensional) NMR 실험을 위해, 15N, 13C-double labeling하여 가장 최적의 조건에서 His6-Sur2391-582를 제조하였고, HNCO, CACBCONH, CABNH, NOESY와 같은 3D NMR data를 얻었다. 더 나아가 이 결과는 Sur2와 ESX-Sur2 complex의 구조분석에 이용될 수 있을 것으로 기대된다. ;Her2 (human epidermal growth factor receptor 2) is overexpressed in about 30% of human breast cancer. It has been known as a member of human epidermal growth factor receptor family. Herceptin, a monoclonal antibody of Her2, is clinically used in the therapy of the Her2 positive breast cancer. It needs some kinds of therapeutical improvement. Because, in many case, Herceptin-treated patients show drug-resistance within a year after starting treatment and the metastasis to brain due to its big size, leading not to penetrale blood brain barrier. In addition, antibody therapy inhibits Her2 protein already overexpressed. Therefore it will be better to find out another approach which can target to control the level of the protein in transcription level. Several studies have shown that the overexpression of Her2 gene is related to the interaction with an epithelial-specific transcription factor, ESX. It binds to the promoter of Her2 and activates the Her2 gene expression. And also, interaction between ESX and its coactivator, Sur2 (Ras-linked subunit of human mediator complex), enhances the ESX transcriptional activity. Therefore, the inhibition of ESX-Sur2 interaction can down-regulate the Her2 expression level. For this reason, the interaction between ESX and Sur2 can be a good target for Her2 positive human breast cancer therapeutics. In order to design rational ESX-Sur2 inhibitors, it may be important to understand structural change of Sur2 protein induced by binding to ESX and how Sur2 binds to ESX, first of all, the structure of only Sur2 needs to be determined. Further, the structural analysis on ESX-Sur2 binding interface will let us understand the mechanism of Sur2-ESX interaction in physiological condition. This study has been performed to determine the binding core of Sur2 to ESX using secreted alkaline phosphatase assay. Sur2391-582 minimum binding core was cloned and successfully expressed in E.coli using pET28a_Sur2391-582 to obtain His-tagged Sur2391-582 protein. The expressed His6-Sur2391-582 protein confirmed as a soluble protein after induction by isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, was purified using affinity chromatography and FPLC with a size exclusion column of Superdex 75. The purity of His6-Sur2391-582 was more than 95%. The condition to express and purify 15N-labeled His6-Sur2391-582 was also optimized for two dimensional NMR experiment. 15N-labeled sample was used for Sur2 titration into ESX in NMR experiment. Some NMR signal movements of Sur2 by ESX addition was observed, His6-Sur2391-582 interacted with ESX. 15N, 13C double-labeled His6-Sur2391-582 prepared with optimized conditions for expression and purification and utilized for NMR data collection through a set of 3D NMR experiments such as HNCO, CACBCONH, CACBNH and NOESY. Structural analysis on Sur2 and ESX-Sur2 complex will be performed with these results.-
dc.description.tableofcontentsⅠ. Introduction 1 Ⅱ. Materials and Methods 9 A. Materials 9 B. Methods 11 1. SEAP assay 11 a. Cell culture 11 b. Transfection and SEAP assay 11 2. Cloning 13 3. Fusion protein expression 16 a. Small scale 16 b. Large scale 18 4. Fusion protein purification 20 a. Affinity chromatography 20 b. Size exclusion chromatography 22 5. Stability test 22 6. Secondary structure prediction & CD spectrum 23 a. Secondary structure prediction 23 b. CD spectrum 23 7. Mass experiment 24 8. NMR experiment 25 a. 15N-labeling protein expression and purification 25 b. ESX-Sur2 protein titration 25 c. 15N, 13C-labeling protein expression and purification 26 d. 3D NMR experiment 26 Ⅲ. Results 28 A. Minimum binding core determination and cloning 28 1. SEAP assay 28 2. Cloning 30 B. Fusion protein experiment 32 1. Protein expression 32 2. Protein purification-affinity chromatography 35 3. Buffer stability test 36 4. Secondary structure prediction and CD spectrum 37 a. Secondary structure prediction 37 b. CD spectrum 38 5. Mass experiment 39 C. 15N-labeling protein experiment 40 1. 15N-labeling protein expression, purification and 2D-HSQC 40 a. 15N-labeling protein expression and purification 40 b. NMR experiment 2D-HSQC 41 2. ESX-Sur2 titration experiment 42 D. 15N, 13C-labeling protein experiment 44 1. 15N, 13C-labeling protein expression, purification 44 a. 15N,13C-labeling protein expression and purification (affinity chromatography) 44 b. 15N,13C-labeling purification (size exclusion chromatography) 45 2. 3D NMR experiment and processing 46 Ⅳ. Discussion 47 참고문헌 50 부록 58 Abstract 64-
dc.format.extent2630026 bytes-
dc.publisher이화여자대학교 대학원-
dc.titleExpression, purification and structural analyses of Sur2 protein containing binding core for ESX-
dc.typeMaster's Thesis-
dc.format.pagexi, 65 p.-
dc.identifier.major대학원 생명·약학부약학전공- 2-
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