Identification of EEIG1 as a novel RANK signaling complex

Abstract

Receptor activator of NF-ĸB (RANK), a tumor necrosis factor receptor (TNFR) family protein, plays an essential role in osteoclast differentiation and function. Ligation of RANK with its ligand, RANKL, activates several signaling pathways, thereby inducing the expression of osteoclast-specific genes such as NFATc1, TRAP, and cathepsin K. In this study, we identified a novel RANKL-inducible protein, early estrogen-induced gene 1 (EEIG1). A series of studies using deletion and mutant constructs elucidated that EEIG1 associates with RANK in a specific motif, 532GDIIVV537. To verify the importance of RANK 532GDIIVV537 motif, we generated murine macrophage RAW264.7 cells that stably express RANK wild type or 532AAAAAA537 mutant and identified that osteoclast formation was failed when 532GDIIVV537 was mutated. Osteoclast differentiation was also inhibited when bone marrow-derived monocytes/macrophages (BMMs) were infected with RANK 532AAAAAA537 mutant. The identification of a novel protein that interacts with RANK and is involved in the regulation of osteoclast differentiation may be useful for understanding the mechanism of osteoclastogenesis.;RANK는 TNFR family에 속하는 단백질로 파골세포(Osteoclast)의 분화와 기능에 필수적인 역할을 한다. RANK가 리간드인 RANKL과 결합하면 하위 신호전달계를 활성화시켜 NFATc1, TRAP, Cathepsin K와 같은 파골세포 특이적인 유전자의 발현을 유도한다. EEIG1 (Early estrogen induced gene 1)은 gene chip을 이용하여 찾은 RANKL에 의해 유도되는 유전자로 아직까지 그 기능이 밝혀지지 않았다. Deletion construct와 mutation construct를 이용하여 실험한 결과 EEIG1이 RANK의 532GDIIVV537 motif 에 결합한다는 것을 알 수 있었다. 532GDIIVV537 motif의 중요성을 입증하기 위해 RANK WT 또는 RANK 532AAAAAA537 Mt 을 과발현하는 stable Raw264.7 cell을 만들어 파골세포 분화와 신호전달계를 비교하였다. 그 결과, 532GDIIVV537의 아미노산을 모두 알라닌으로 치환한 532AAAAAA537 Mt가 과발현되는 stable Raw 264.7 cell 에서는 파골세포로의 분화가 억제되었다. Retroviral infection으로 인해 RANK 532AAAAAA537 Mt가 과발현되는 BMM (Bone marrow macrophage) 에서도 파골세포 분화가 억제되는 것을 볼 수 있었다. 이러한 결과는 EEIG1이 파골세포의 분화 기작을 이해하는데 중요한 역할을 하리라는 것을 시사한다