Novel function of SH3YL1 protein in cancer cells through Nox1 regulation

Abstract

활성산조종(Reactive oxygen species)은 유기호흡을 하는 생물에게 있어 필수적인 산소가 세포 내의 효소 그리고 대부분의 전자 운반 과정 혹은 에너지대사 과정 중에 불완전하게 환원되거나 펩티드 성장인자, cytokine들 및 다양한 작용의 자극에 의해 발생된다. 이 활성산소종은 free radical을 가져 안정하지 못한 상태를 말하며, 그로 인해 강한 활성을 나타낸다. 활성산소종은 생산이 과잉되면 생체에 대한 독성 즉 산화적 손상(oxidative stress)을 가져온다 하여, 유해산소라고 명명되기도 하는데, 세포내의 단백질, 지질과 같은 거대한 분자를 산화시킴으로써 세포의 항상성을 파괴하고, 세포를 사멸시키는 등 세포조직 내에 치명적인 손상을 유발하며, 암, 근이형증, 알츠하이머병, 파킨슨씨병, 허혈성질환, 동맥경화증과 같은 다양한 퇴행성 질병의 원인과 일반적 노화와 관계가 있다. 하지만 연구가 진행됨에 따라 활성산소종이 낮은 농도에 있어서는 세포내 신호전달 과정에 관여하는 2차 신호전달 물질(second messenger)임이 밝혀졌다. 이러한 2차 신호전달 물질은 오히려 유전자 발현, 세포 성장, 세포 분화, 분비, 세포 이동과 신경전달과정 등의 생리적 반응들을 유도하는 기능을 가진다는 것이 밝혀짐으로써 세포 사멸을 유도하는 인자로 인식되어 왔던 활성산소가 근래에 와서는 그 반대로 세포 사멸을 억제할 수 있음이 확인되고 있다. 적절한 활성산소종의 생성은 세포의 증식과 생존을 촉진시키는 역할을 하지만 활성산소종 생성이 적정 수준을 넘어서게 되면 세포 사멸 과정을 유도하게 된다. 그런데 암세포는 정상세포에 비해 활성산소종 생성이 증가되어 있으며 redox balance가 깨져있기 때문에 산화적 손상 (oxidative stress)에 더욱 취약하다. NAD(P)H oxidase는 이러한 활성산소종의 중요한 생성원으로 알려져 있으며 그 메커니즘은 Neutrophil, monocyte, macrophage와 같은 포식세포에 존재하는 NAD(P)H oxidase 2 (Nox2, gp91phox)의 연구를 통해 밝혀지게 되었다. 이 효소는 두 개의 막 단백질인 gp91phox와 p22phox와 세 개 이상의 세포질 단백질들(p67phox, p47phox, p40phox, Rac1 or 2)로 이루어져 있다. 외부자극이나 병원균의 침입에 의해 세포질 내에 존재하는 단백질들이 인산화효소에 의해 인산화되고 그것은 단백질들 사이의 결합을 유도하여 그 결과 효소적 활성을 가지는 NAD(P)H oxidase complex가 형성되고, 이를 통해 전자의 이동이 일어나 활성산소종이 생성된다. 이렇게 생성된 활성산소종은 포식세포의 면역과정에서 침입한 병원균을 포식세포 내로 함몰하여 죽이는 과정에서 중요한 역할을 한다. 최근 포식세포뿐만 아니라 비포식세포를 포함한 다양한 세포에서 Nox2의 다양한 유사체(Nox1, Nox3, Nox4, Nox5, Duox1, Duox2)가 발견되었으며 이 유사체들은 구조상의 유사성에도 불구하고 발현되는 조직이나 효소 활성에 요구되는 보조인자의 종류, 생성하는 활성산소종의 양, 그리고 관련되는 생리학적인 기능 등에서 큰 차이를 보인다. 그 중 처음으로 발견된 Nox1은 Nox2와 56%의 유사한 아미노산 구조를 보이며 활성산소를 생성하는데 있어서 중요한 보조인자인 p47phox, p67phox가 동일하게 작용한다는 것과 그 외에도 보조인자의 유사체인 Noxo1, Noxa1이 존재하여 그 단백질들에 의해서도 Nox1의 효소활성이 조절된다고 보고되었다. 이전 연구에서 Yeast two hybrid system을 이용하여 Nox1과 결합하는 여러 단백질을 찾아내었고 그 중 SH3YL1이 발견되었는데 이 SH3YL1은 Noxo1과도 결합하였다. 이 단백질은 쥐에서 먼저 연구가 되었는데 모발이 자라는 시기에 많이 발현된다고 보고 되었으며 사람의 단백질과는 97%의 유사성을 보인다. 사람의 단백질인 SH3YL1은 그 기능에 대해 밝혀진 것이 없는 새로운 단백질이다. 이전 연구에서 우리는 SH3YL1이 Noxo1과 강한 결합을 보이며 SH3YL1이 과발현 되어있을 때, 성장인자에 의해 유도되는 Nox1의 활성산소종 생성이 저해되는 것을 확인하였다. 먼저 우리는 co-immunoprecipitation (Co-IP)를 통해 SH3YL1 W303R/W304R mutant가 Noxo1과 결합하지 못하는 것을 알 수 있었다. SH3YL1 WT과 SH3YL1 W303R/W304R mutant가 NADPH oxidase 1의 효소 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해 우리는 SH3YL1 WT과 SH3YL1 W303R/W304R mutant를 과발현 시킨 상태에서의 활성산소종의 생성을 측정해보았다. 그 결과 SH3YL1 WT이 과발현 되어 있을 때, Nox1의 활성산소종 생성이 저해되는 것과 SH3YL1 W303R/W304R mutant가 과발현 되어 있을 때, 활성산소종 생성이 회복되는 것을 확인하였다. 우리는 SH3YL1이 여러 암세포에서 발현이 증가되어 있다는 것을 확인하였기 때문에 SH3YL1 단백질이 암세포에서 어떤 기능을 하는지 확인해보았다. SH3YL1 발현을 억제시킨 상태에서 HCT-116 대장암 세포의 활성산소종 생성을 측정하였다. SH3YL1의 발현 억제는 성 활성산소종 생성을 증가시켰고 SH3YL1의 발현 억제는 세포의 증식과 종양형성을 감소시키는 것을 SRB assay와 soft agar assay를 통해 확인 할 수 있었다. SH3YL1의 발현 억제가 세포 사멸에 영향을 미치는지 여러 apoptosis assay를 수행하였다. Annexin V assay, Caspase-3의 발현, TUNEL assay를 통해 확인한 결과 SH3YL1 발현 억제는 세포 사멸을 유도한다는 사실을 확인할 수 있었다. 이를 통해 SH3YL1 발현 억제가 활성산소종 증가를 유도하며 이 활성산소종은 세포 사멸을 촉진하는데 기여한다고 할 수 있다. 위의 결과들을 종합하여 볼 때 SH3YL1이 외부자극에 의한 NADPH oxidase 1 complex의 온전한 형성을 방해함으로써 활성산소종의 생성을 조절한다는 사실을 알 수 있다. 또한 SH3YL1이 암세포에서 활성산소종의 생성을 조절하며 암세포의 악성의 형질을 유지하는데 기여한다고 예상된다. ;Previous studies suggested that Src homology 3 domain containing Ysc84-like1 (SH3YL1) interacts with proline-rich region of Noxo1. It was shown that the interaction interfered Noxo1-Noxa1 complex formation resulting in decreased NADPH oxidase 1 (Nox1) activity and reactive oxygen species (ROS) generation in response to EGF. It has been well established that ROS play an important role in carcinogenesis. In this thesis, I focused on the role of SH3YL1 in cancer cell lines and carcinogenesis. SH3YL1 was highly expressed in cervical cancer tissues and other cancer cell lines. To determine SH3YL1 function in cancer cell lines, I used HCT-116 cells, colon cancer cells, which contain high amount of SH3YL1 protein. To determine SH3YL1 function in carcinogenesis, we used specific siRNA to SH3YL1. Knockdown of SH3YL1 in HCT-116 cells resulted in increase of ROS generation and the cell proliferation was decreased on SRB assay. Anchorage-independent growth on soft agar assay indicates that knockdown of SH3YL1 expression reduced colony numbers by 40% compared to control siRNA cells. Several lines of evidence indicate that ROS regulates PTK activity and then stimulates cell survival cascades. To verify the function of SH3YL1 regarding on ROS generation in apoptosis, I analyzed cell death mechanism. Knockdown of SH3YL1 in HCT-116 cells resulted in increased apoptotic cells compared to control siRNA transfection. Moreover, knockdown of SH3YL1 stimulated caspase 3 activation. Taken together, these studies show that SH3YL1 may be contribute to maintain cancer malignant phenotypes through downregulation of Nox1 activity.