Receptor-mediated Activation of NADPH Oxidases and Phospholipase C-γ1

Abstract

활성산소는 생물학적 현상들이 진행되면서 필연적으로 생성되는 부산물로 과거에는 DNA변이나 단백질의 산화, 지질의 과산화 등을 일으키는 해로운 물질로 간주되었다. 그러나 활성산소의 생성을 일차적인 기능으로 하는 Nox family NADPH oxidase의 발견에서부터 비롯하여 최근에는 활성산소가 다양한 생물학적 현상을 매개하는 신호전달물질로 작용하고 있음이 잘 밝혀져 있다. 세포 내 활성산소의 여러 생성인자 중에서 특히 nonphargocytic NADPH oxidase는 PDGF, EGF, insulin, TNF-α, IL-1과 같은 성장인자나 cytokine에 의한 활성산소 생성의 주요 원인으로 알려져 있다. 본 학위 논문의 첫 번째 부분에서는 PDGF 또는 angiotensin type I 수용체를 통해 일어나는 Nox1과 Nox5의 활성화 기작에 관한 연구 결과를 다루고 있다. 우선 여러 수용체를 통한 Nox5의 효소 활성을 알아보기 위해 Nox5를 PDGF 수용체나 angiotensin type I 수용체, insulin 수용체와 함께 과발현시킨 뒤 세포 밖으로 생성되는 활성산소를 측정하였다. Nox5에 의해 생성되는 superoxide는 다른 조절 단백질들의 도움 없이 우선적으로 세포 내 칼슘이온의 농도에 의해 조절되는 것으로 알려져 있다. Angiotensin type I 수용체와 PDGF 수용체는 모두 신호전달과정 초기에 세포 내 칼슘이온의 증가를 유발시키기 때문에 Nox5가 이들 수용체를 통한 신호전달 과정에서 활성화 될 것으로 예상하였다. 실제로 Nox5의 reconstitution system에서 Ang II와 PDGF는 충분히 superoxide의 생성을 촉진시켰으며, superoxide의 생성은 수용체를 통해 일어나는 칼슘이온의 증가와 밀접하게 관련되어 있음을 확인하였다. PDGF 수용체의 다양한 mutant를 발현시켜 활성산소를 측정한 결과 PLC-1의 활성이 PDGF에 의한 Nox5 활성화에 반드시 필요함을 확인하였고, PI3K 또한 세포 내 칼슘이온 증가를 강화시켜 Nox5의 효소 활성을 증가시키는 데에 상당히 관여하고 있음을 관찰하였다. Superoxide가 생성되는 속도나 생성되는 양은 세포 안팎의 칼슘이온을 킬레이션 했을 때 모두 감소되었다. 뿐만 아니라 PKC의 활성은 Nox5의 인산화 등을 조절함으로써 Nox5가 최대 활성을 나타낼 수 있도록 기여하고 있음을 증명하였다. Part I-2에서는 PDGF 수용체를 통한 Nox1의 활성화 기전을 알아보기 위해 wild type 또는 mutant PDGF 수용체를 Nox1 components (Nox1, Noxo1, Noxa1)와 함께 과발현시킨 세포에서 superoxide를 측정하였다. PDGF 수용체 자체의 kinase 활성은 PDGF에 의한 superoxide 생성에 필수적이었다. PLC-γ1의 수용체 결합을 방해하면 superoxide 생성이 완전히 억제되는 결과를 얻었고, 이것은 PDGF 수용체를 통한 Nox1의 활성화에 PLC-γ1을 통한 하부 신호전달과정이 필수적임을 설명해준다. PI3K를 통한 신호전달 과정만 진행되는 경우에는 Nox1에 의한 superoxide 생성을 전혀 유도하지 못했으나, 실제로 PI3K도 Nox1의 활성에 상당히 관여하고 있음을 관찰하였다. 추가적으로, H2O2를 선택적으로 측정할 수 있도록 개발된 HyPer probe를 이용하여 Nox reconstitution system에서 생성되는 세포 내 활성산소를 측정하였고, PDGF에 의한 Nox1과 Nox5의 활성화에 의해 결과적으로 세포 내 활성산소의 양이 증가됨을 확인하였다. 선행 연구를 통해 phage display 방법을 이용하여 PLC-γ1의 인산화된 Y783 잔기를 선택적으로 인지하는 세 가지 형태의 재조합 항체를 개발하였고, Part II에서는 제작된 항체들의 기능을 확인하는 실험들을 진행하였다. PLC는 phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate를 diacylglycerol (DAG)과 inositol 1,4,5-triphosphates (IP3)로 가수분해하는 효소로, PLC에 의해 생성된 DAG와 IP3는 각각 PKC의 활성화와 세포 내 칼슘이온의 증가를 유도하여 세포 내 신호전달물질로 작용하게 된다. 구조적 특성에 의해 PLC-γ1의 활성화는 tyrosine 잔기의 인산화에 의해 일어나게 되며, 특히 PLC-γ1의 Y783 잔기의 인산화는 PLC-γ1의 활성화 기전에 필수적으로 C-terminal SH2 domain과의 상호작용을 통해 결과적으로 PLC-γ1이 최대로 효소 활성을 나타낼 수 있게 한다. 따라서 PLC-γ1의 인산화된 Y783잔기에 선택적으로 결합하는 세포 내 항체를 발현시키면 PLC-γ1의 효소활성을 억제시킬 수 있을 것으로 기대하였다. 우선 선택적으로 PLC-γ1의 인산화된 Y783 잔기만을 인식하는 항체 클론을 ELISA 방법을 이용하여 선택하였고, 선택된 항체 클론으로 ELISA와 immunoblot analysis를 수행하여 PLC-γ1의 인산화된 Y783 잔기에 높은 선택성을 가지고 있음을 재검증하였다. 또한 제작된 항체는 PLC-γ1의 인산화된 Y783 잔기에 상응하는 PLC-γ2의 인산화된 Y759 잔기에는 결합하지 않음으로써 isotype에 대한 특이성을 지니고 있음을 확인하였다. PLC-γ1의 pY783 scFv를 transfection이나 adenoviral infection으로 세포 내 발현시킨 결과 예상대로 pY783 scFv는 PDGF를 처리했을 때 PLC-γ1을 통해 일어나는 칼슘 이온의 증가를 효과적으로 억제시키는 것을 관찰하였다. 뿐만 아니라 PLC-γ1 pY783 scFv의 isotype 특이성은 세포 내 발현 시에도 동일하게 나타남을 확인하였다. 위의 결과들을 종합해보면, PLC-γ1의 인산화된 Y783 잔기에만 특이적으로 결합하는 PLC-γ1 pY783 scFv는 세포 내 신호전달 시 유도되는 PLC-γ1의 활성을 매우 선택적으로 억제시키기 위해 유용하게 사용될 수 있음을 기대할 수 있다.;Reactive oxygen species (ROS) have been considered as an unavoidable by-product of biological reactions, which cause molecular damages such as DNA mutation, protein oxidation, and lipid peroxidation. Essential roles of ROS in biological processes, however, have recently been elicited from identification of Nox family NADPH oxidases, whose function is primarily to produce ROS. At present, ROS are known to be involved in a variety of physiological responses serving as a second messenger. Of several sources of ROS in cells, nonphagocytic NADPH oxidases have been regarded as major sources of ROS produced in response to various growth factors and cytokines including PDGF, EGF, insulin, TNF-α, and IL-1. In Part I of this dissertation, PDGF receptor- or angiotensin type I receptor-mediated activation of NADPH oxidases, restricted to Nox1 and Nox5, was investigated. First, to study the activation of Nox5 in various receptor signaling, we reconstituted Nox5 with angiotensin type1 receptor (AT1R), PDGFβ receptor (PDGFβR) or insulin receptor. Superoxide production by Nox5 primarily depends on the level of intracellular Ca2+ without the assembly of regulatory proteins. AT1R and PDGFβR are suitable for mediating Nox5 activation in that elevation of intracellular calcium is triggered in the early signaling of both receptors. In our Nox5 reconstitution systems, Ang II and PDGF remarkably promoted superoxide generation. Superoxide production was closely linked to receptor-mediated calcium mobilization. Studies on superoxide production using various PDGFR mutants revealed that PLCγ activation was indispensable to PDGF-induced Nox5 activation. Also, PI3K considerably participated in increasing Nox5 activity due to enhancement of calcium release. The amount and rate of superoxide production was reduced with intra- or/and extracellular calcium chelation. Moreover, protein kinase C activation was necessary for full activation of Nox5 including phosphorylation of Nox5. PDGFR-mediated activation of Nox1 was examined as well in Part I-2. Extracellular superoxide production was monitored in cells expressing wild-type or mutant PDGFR with Nox1 components (Nox1, Noxo1, and Noxa1). Intrinsic kinase activity of PDGFR was required for superoxide release in response to PDGF. PLC-γ1-mediated signaling pathway was critical for PDGF-induced Nox1 activation, as demonstrated by the result that abrogation of PLC-γ1 binding site completely inhibited superoxide generation. Contribution of PI3K was also considerable although PI3K alone did not promote Nox1-dependent superoxide production. In order to measure intracellular ROS, HyPer probe was applied in Nox reconstitution system that had been used in previous studies. This probe is known to detect H2O2 with high specificity. PDGF transiently increased the level of intracellular H2O2 through Nox1 or Nox5. On the other hand, Nox5-dependent generation of intracellular H2O2 was scarcely detected by stimulation with Ang II, despite of remarkable increase of extracellular superoxide within the same cell. Three forms of recombinant antibodies (Fab, minibody and scFv) specific for pY783 residue of PLC-γ1 had been developed by phage display technology, and characterized in Part II. Phospholipase C (PLC) hydrolyzes phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate into diacyglycerol and inositol 1,4,5-triphosphates. These intracellular second messengers induce the activation of protein kinase C and the intracellular calcium mobilization, respectively. Activation of PLC-γ1 depends on tyrosine phosphorylation due to structural features. Phosphorylation at Y783 residue of PLC-γ1 is critical for activation mechanism, leading to full phospholipase activity following the intramolecular interaction with C-terminal SH2 domain. Accordingly, scFv specific for pY783 residue of PLC-γ1 was expected to inhibit lipase activity of activated PLC-γ1. In this study, antibody clone which specifically recognized pY783 residue of PLC-γ1 was selected by ELISA. Selected clone showed high affinity to pY783 of PLC-γ1 in ELISA and immunoblot analysis. These antibody fragments also distinguished pY783 of PLC-γ1 from pY759 of PLC-γ2, which corresponds to pY783 of PLC-γ1. As expected, the intracellular expression of scFv significantly reduced intracellular calcium elevation in PDGF-stimulated NIH3T3 cells and HepG2-PDGFR cells. Isotype specificity of pY783 scFv was confirmed as well. Taken together, it is speculated that site-specific inhibition of PLC-γ1 using pY783 scFv can be a useful method to selectively regulate PLC-γ1 activity in cell signaling.