A large-scale screening for human bromodomain proteins that function in DNA damage response

Abstract

인산화, 아세틸화 그리고 메틸화와 같은 핵심 히스톤의 변이가 DNA 손상 반응 (DDR) 에서 중요한 역할을 한다는 증거들이 제시되고 있다. 예를 들어, DNA 손상에 대한 반응으로, 히스톤의 H2AX가 신속히 인산화되고, 핵 안에서 foci를 형성함으로써 DNA 손상을 복구시킬 수 있는 다음 과정들이 시작된다. H2AX의 인산화는 유전체 안정성을 유지시키고 크로모좀의 절단이 효율적으로 복구되는데 중요하다. 이전 연구에서 SWI/SNF 복합체의 주요 단백질인 BRG1은 bromodomain을 통하여 DNA 이중 나선 절단 부위에 있는 아세틸화 된 히스톤에 결합함으로써 H2AX의 인산화가 촉진된다고 밝혀진 바 있다. 따라서 이를 통하여 BRG1의 bromodomain은 DNA 손상 반응에서 BRG1의 기능에 대한 dominant negative 억제자로서 작용을 할 것이라고 예상할 수 있다. 이러한 가설을 토대로, bromodomain의 dominant negative 효과를 살펴보았다. 우선 사람의 단백질에서 54종류의 bromodomain을 찾아서 발현벡터를 만들었으며, 이러한 bromodomain들로 DNA 손상후에 오는 세포생존력과 H2AX의 인산화 유도를 실험하였다. 그 결과, Cecr2 유전자만이 세포생존력과 H2AX의 인산화 영향에 대한 정도가 BRG1의 bromodomain정도의 수준으로 나타나는 것을 보았다. Cecr2는 CERF 크로마틴 리모델링 복합체의 한 구성요소로서 아직 세포 내 기능이 밝혀져 있지 않았으나, 이러한 실험결과를 통하여 Cecr2가 DNA 손상 반응에서 새로운 크로마틴 리모델링 인자로서 기능을 할 것이라고 예상한다. 따라서, DNA 손상에 대한 과민반응과 H2AX 의 인산화에 결함을 가지는 Cecr2의 bromodomain에 초점을 두고 DNA 손상 반응에서의 Cecr2 단백질의 기능에 대하여 분자생물학적인 메커니즘을 연구 할 계획이다.;Evidence suggests that post-translational modifications of the core histones, such as phosphorylation, acetylation and methylation, play important role in DNA damage response (DDR) as well as in transcription. For example, in response to DNA double strand breaks (DSBs), histone H2AX is rapidly phosphorylated (g-H2AX) and forms microscopically visible nuclear foci, which triggers the cascades of downstream pathways of DDR in a highly coordinated fashion. g-H2AX is crucial for efficient repair of chromosomal breaks and the maintenance of genome integrity. Our laboratory has previously shown that BRG1, the catalytic subunit of the SWI/SNF chromatin remodeling complex, promotes g-H2AX formation by binding to acetylated histones on the chromatin around DSBs via its bromodomain (BRD), and that BRG1 BRD when ectopically expressed in the cells acts as a dominant negative inhibitor of the BRG1 function in DDR. These results led to hypothesis that identifying BRDs with such dominant negative effect would allow for finding proteins that function in DDR. In this thesis, I screened for human bromodomains that have dominant negative effect on DDR when expressed in the cells. I constructed the expression vectors for 54 different BRDs found in a variety of human proteins, and examined the effects of these BRDs on cell survival and g-H2AX induction after DNA damage. As a positive control, BRG1 BRD largely reduced cell survival and severely compromised g-H2AX formation after DNA damage. Among the 54 BRDs tested, only BRD of the cat eye syndrome chromosome region candidate 2 (Cecr2) gene showed the effects on both cell survival and g-H2AX at the levels compatible to BRG1 BRD. Several BRDs, such as those present in Brd4, Baz1B and SNF2b showed significant effect on either cell survival or g-H2AX induction but not on both pathways. Cecr2 is known to exist as a component of CERF chromatin remodeling complex and its cellular function is not known. It is possible that Cecr2 functions as a novel chromatin remodeling factor in DDR. Future studies will be focused on understanding the molecular mechanisms by which Cecr2 BRD confers DNA damage hypersensitivity and defective g-H2AX as well as on elucidating the role of Cecr2 protein in DDR.