View : 89 Download: 0

Characterization of CKLFSF7, a protein containing a MARVEL domain

Title
Characterization of CKLFSF7, a protein containing a MARVEL domain
Other Titles
MARVEL 도메인을 갖는 CKLFSF7의 특성
Authors
강민지
Issue Date
2010
Department/Major
대학원 생명·약학부생명과학전공
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Master
Advisors
윤영대
Abstract
파트 1:MARVEL 도메인을 갖는 CKLFSF7의 특성 CKLFSF7은 현재까지 기능이 규명되지 않은 단백질이며, Northern 분석 결과 leukocyte에서 발현되는 유전자로 발견 되었다. 따라서 이 논문에서는 CKLFSF7이 면역세포에서 어떤 기능을 하는지 밝히고자 하였다. CKLFSF7은 4개의 transmembrane 부위와 한 개의 MARVEL domain을 보유하는 단백질이다. MARVEL domain을 보유하는 단백질에 대한 지금까지의 연구 결과를 통해 MARVEL domain은 membrane juxtaposition과 vesicle trafficking에 관여한다고 알려져 있다. CKLFSF7의 기능에 대한 연구를 위해 우선 항체를 제작하였으며, 제작된 항체를 이용하여 면역 세포 주에서의 발현을 조사한 결과 CKLFSF7이 면역세포 (T 세포, B 세포, Macrophage) 에서 발현한다는 것을 알 수 있었다. 또한 mouse에서 T 세포를 분리하여 TCR 신호자극 및 IL-2 자극을 통하여 activated T 세포 및 effector T 세포로 분화 시킨 후 각 분화 단계의 세포에서 CKLFSF7의 발현을 분석한 결과, effector T 세포에서 CKLFSF7의 mRNA 및 단백질 발현이 현저하게 증가함을 관찰하였다. 따라서 CKLFSF7은 effector T 세포에서 특정 기능을 할 것으로 생각된다. 다른 MARVEL domain 단백질인 MAL 의 경우 vesicle transport에 관여하는 단백질로 알려져 있으며, 또한 면역세포에서 연구된 바에 의하면 항원제시세포와 T 세포의 conjugation 시 perinuclear에 위치하던 단백질이 immunological synapse로 위치가 변하는 것을 확인하였다. 동시에 MAL의 발현이 억제된 세포에서는 Lck가 immunological synapse로 가지 못하는 현상을 관찰된바 있다. 따라서 MAL은 immune synapse로 targeting하는 단백질의 이동에 관여하는 단백질로 알려져 있다. CKLFSF7 또한 MARVEL domain을 갖는 단백질로써 IS conjugation시 어디에 위치하는지 분석 하였다. Jurkat T 세포에 GFP가 tagging된 CKLFSF7을 과 발현 시키고 APC와 conjugation시 CKLFSF7의 위치가 cytoplasm 에서 immune synapse로 이동하는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과는 CKLFSF7이 immune synapse로 targeting되는 단백질의 이동에 관여 할 가능성을 시사한다. 또한 CKLFSF7의 세포 내 위치를 정확하게 확인하기 위하여 NIH3T3 세포에CKLFSF7-GFP 단백질을 발현시키고, confocal microscope를 사용하여 위치 분석한 결과, CKLFSF7은 trans-Golgi에 위치하는 것을 관찰하였다. 또한 CKLFSF7 아미노산 서열에 세포 외로 분비되는 단백질의 이동에 관여하는 tyrosine based sorting motif (YXXΦ)가 존재함을 확인하였다. 세포 내에서 vesicle transport carrier로 작용하는 단백질들은 대개 trans-Golgi에 위치한다는 사실에 비추어 CKLFSF7은 합성된 단백질의 세포 외 분비나 plasma membrane으로의 이동에 관여 할 것으로 생각된다. 이 논문에서 구체적인 CKLFSF7 기능을 정립하지는 못하였지만, CKLFSF7의 면역세포에서 발현 확인, immune synapse로의 이동 및 trans-Golgi에 위치 함을 확인함으로써 CKLFSF7이 면역세포에서 단백질의 분비나 plasma membrane으로의 이동에 관여하는 단백질임을 예측 가능하게 되었다. 파트2: Lck 통한 신호 전달시 Chat-H 결합 단백질 규명 immunoreceptor 또는 chemokine receptor 통한 세포 내 신호전달은 integrin 활성화로 연결되며 이와 같은 신호 전달 기작을 inside-out signaling 이라 한다. Inside out signaling 은 integrin의 conformation 변화시키고 clustering을 유도함으로써 ligand에 대한 affinity 및 avidity를 증가시킨다. T 세포에서 T 임파구 수용체를 통한 inside-out signaling은 항원제시세포와의 결합부위에 활성화된 integrin clustering을 유도함으로써 immunological synapse의 형성을 강화시키고 T 세포의 활성화를 증가시킨다. T 임파구 수용체를 통한 inside-out signaling은 Rap1과 Rac1 small GTPase의 활성화를 통해 integrin의 conformation 변화 및 clustering을 유도하는 것으로 알려져 있다. Rap1은 C3G GEF를 통해 GTP 결합형태의 활성화 상태가 되어 integrin의 cytoplasmic tail 근처에 RAPL, RIAM 등을 recruit 시킴으로써 integrin-associated signaling complex를 형성시킨다. Rap1의 활성을 유도하는 신호 전달 경로는 크게 ADAP/SKA55 complex에 의한 경로와 Cas(HEF1)/Crk/C3G complex에 의한 경로로 구분된다. 반면 Rac 1은 주로 VAV GEF를 통해 활성화 되고, actin polymerization을 유도하며 inside-out signaling에 관여하는 단백질complex의 형성을 촉진하고, membrane 상에서 integrin의 이동을 도와 clustering 시키는 역할을 한다. 최근 TCR 자극에 의한 integrin 활성화, 즉 ‘inside-out signaling’ 을 조절하는 기전에 관여하는 단백질들에 대한 연구가 활발히 진행되는 가운데 면역세포 특이적으로 발현되는 Chat-H가 발견되었다. Chat-H는 위에서 언급한 Rap1을 활성화 시키는 HEF1과 결합하는 것으로 알려져 있다. 기존 연구 결과에 의하면, siRNA를 이용하여 T 세포 주에서 Chat-H의 발현을 저해하였을 때, TCR의 신호에 의한 T 세포의 증식 및 IL-2 분비가 저해되고 또한 integrin 활성이 저해되어 cell adhesion이 감소하는 것이 보고 되어있다. 즉, immune receptor 또는 cheomokine receptor를 통한 inside-out signaling에 Chat-H가 관여한다. 이 논문에서는 HEF1 외에 Chat-H와 결합하는 단백질을 판명함으로써 Chat-H가 어떻게 TCR 통한 신호를 매개하여 integrin을 활성화 시키는지 밝히고자 했다. 따라서 Lck active form을 fusion시킨 Chat-H를 bait로 하여 Yeast two hybrid screening을 하였다. 결합 단백질로 확인된 대부분의 단백질은 SH2 domain을 가지고 있지 않았다. SH2B1은 SH2 domain을 가지고 있고 Rac1을 통한 cell mobility 조절에 관여한다고 알려져 있지만 실제 Chat-H와의 결합은 볼 수 없었다.;part1: Characterization of CKLFSF7, a protein containing a MARVEL domain The chemokine like factor superfamily (CKLFSF) is a novel family of proteins consisting of at least nine members, CKLF and CKLFSF 1-8. CKLFSFs have four putative transmembrane regions, except for CKLFSF3 containing three transmembrane regions. However, they are not classified as tetraspanin because they lack a Cys-Cys-Gly sequence (the CCG motif) within the large extracellular loop of the protein. Instead, CKLFSFs have a MARVEL domain that is found in proteins involved in the vesicle trafficking. MARVEL domain-containing proteins mediate membrane apposition events, such as transport vesicle biogenesis, neurotransmitter secretion and polarized membrane trafficking. Although the function of the CKLFSFs proteins is still unclear, the expression pattern of the CKLFSF protein was identified by northern blot analysis. As CKLFSF7 is specifically expressed in leukocytes, I became interested in defining the function of CKLFSF7 in relation to immune regulation. I confirmed that CKLFSF7 is expressed in leukocyte, especially in T cells, B cells and macrophages. In addition, in primary T cells, the expression of CKLFSF7 was found upregulated in effector T cells, suggesting a possible role of CKLFSF7 in activated and effector T cells. Moreover, upon conjugation of T cells with superantigen SEE-pulsed Raji B cells, CKLFSF7 was localized to the immunological synapse. In addition under the confocal microscopy, CKLFSF7 colocalized with Golgi and transport vesicles in NIH3T3. These findings suggest the possibility that CKLFSF7 may have certain functions in Golgi-transport vesicle or in immunological synapse. part2: identification of the binding partners of Chat-H, Lck associated signal transducer An isoform of Chat, Chat-H is specifically expressed in hematopoietic cells from spleen, lymph node, and thymus. Chat-H interact with CasL/HEF1, a hematopoietic specific member of Cas-family protein. Recently, it was revealed that Chat-H is involved in chemokine-mediated integrin activation pathway. However, the mechanism of involvement of Chat-H in chemokine-mediated inside-out signaling and it’s binding partners are barely identified. In our previous examination, Chat-H was found highly phosphorylated by Src family kinases such as Lck. Based on this observation, tyrosine-phosphorylation-based yeast two-hybrid screening was performed to identify the binding partners of Chat-H. I screened a mouse lymphoma cDNA library using Chat-H as bait, and found several potential Chat-H binding proteins. Especially Chat-H was found to interact with SH2B1, an adaptor protein containing SH2 domain, in an Lck dependent manner. Currently, the association of Chat-H with potential binding partners are being investigated.
Fulltext
Show the fulltext
Appears in Collections:
일반대학원 > 생명·약학부 > Theses_Master
Files in This Item:
There are no files associated with this item.
Export
RIS (EndNote)
XLS (Excel)
XML


qrcode

Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.

BROWSE