Protective role of Peroxiredoxin III and Sulfiredoxin against mitochondrial H₂O₂-mediated damage in cardiomyocytes

Abstract

미토콘드리아는 세포호흡 과정 중에 부산물로서 활성산소종을 생성하는 주된 세포 내 소기관이다. 이렇게 생성된 활성산소종은 세포 내에서 이차적인 손상을 야기하여 병적 상태를 유발할 수 있기 때문에 지속적으로 연구되고 있다. 미토콘드리아에서 생성되는 활성산소종은 세포 내 다양한 항산화 시스템에 의해 제거된다. Peroxiredoxin (Prx)은 과산화수소 (H2O2)를 제거하는 효소로서, 그 중에서도 2-Cys Prx family에 속하는 Prx III는 미토콘드리아에 특이적으로 존재하여, 미토콘드리아에서 생성되는 활성산소종 중 하나인 H2O2를 제거하는 기능을 수행하기 때문에 그 역할이 중요하게 여겨지고 있다. 본 논문에서는 미토콘드리아 H2O2의 증가와 관련된 산화적 스트레스로 인한 사멸 또는 손상작용으로부터 세포를 보호하는 Prx III의 기능에 관하여 연구하였다. 본 논문의 전반부에서는 hypoxia/reoxygenation에 의한 산화적 스트레스로 인한 심장근육세포의 사멸 또는 손상작용을 Prx III가 방어하는 기능을 담당하고 있다는 것을 H9c2 심근세포주를 이용하여 밝혔다. Hypoxia/reoxygenation 상태에서 야기되는 산화적 스트레스는 미토콘드리아에서 증가되는 H2O2와 밀접한 관련이 있으며, 이 때 미토콘드리아 H2O2의 제거를 담당하는 Prx III가 중요한 억제인자로 작용할 것으로 예측되었다. 먼저, RNA interference 방법을 통해 Prx III의 발현량을 억제시킨 후 hypoxia/reoxygenation 상태에서 그 역할을 분석하였다. Prx III의 발현량이 억제되면, 대조군에 비하여 세포사멸이 증가되었다. 이는 미토콘드리아에서 생성된 H2O2 축적 증가, 축적된 H2O2에 의한 미토콘드리아막의 cardiolipin 산화 증가, 이에 따른 미토콘드리아 막전위차 붕괴 증가 등 일련의 과정을 통하여 세포사멸이 증가되는데, 이 때 Prx III는 미토콘드리아 내 H2O2를 제거함으로써 세포사멸을 억제시키는 중요한 기능을 담당하는 것으로 규명되었다. 그러나, H2O2를 제거하는 과정에서 일정 비율의 Prx III는 활성 cysteine 잔기 (Cys-SH)가 과산화되어 Cys-SO2H로 되면서 활성을 상실한다. 따라서, 미토콘드리아 내의 H2O2를 효율적으로 제거하기 위해서는, 미토콘드리아 내에 존재하는 Prx III의 발현량뿐만 아니라 과산화되어 비활성화된 Prx III의 활성을 복구시키는 것도 매우 중요하게 고려되어야 할 요소이다. Sulfiredoxin (Srx)은 Prx III의 과산화된 cysteine을 환원시켜 기능을 복구시키는 역할을 하는 것이 in vitro에서 확인된 바 있다. 그러나, Srx가 세포질에 존재하는 반면에 Prx III는 미토콘드리아에 국한되어 존재하기 때문에, 실제로 세포 내에서 Srx가 미토콘드리아에 특이적으로 존재하는 Prx III의 기능 복구에 관여하는 지는 명확히 밝혀져 있지 않았다. 본 논문에서는 발현량을 증가 또는 억제시키는 연구를 통하여 Srx가 세포질에 존재하는 Prx I과 II 뿐만 아니라 미토콘드리아에 특이적으로 존재하는 Prx III의 환원을 담당한다는 것을 밝혔다. 즉, 세포질에 존재하던 Srx가 산화적 스트레스가 가해지면 미토콘드리아로 이동하여 과산화된 Prx III를 환원시키는 작용을 한다. 이 결과들을 바탕으로, 미토콘드리아에 Srx를 특이적으로 과발현시킨 human embryonic kidney (HEK) 293 세포주를 구축하여 살펴본 결과, 세포 외부에 H2O2 처리 또는 미토콘드리아 complex I 억제제인 rotenone 처리에 의해 과산화되는 Prx III의 환원이 촉진되었고, 세포사멸도 현저히 억제되었다. 한편, H9c2 심근세포주의 경우에 hypoxia/reoxygenation 상태에서 Prx III가 세포질에 존재하는 Prx I 또는 II 보다 더욱 민감하게 과산화되어 활성을 상실하는 것이 관찰 되었다. 따라서, 미토콘드리아에 Srx를 특이적으로 과발현시킨 H9c2 세포주도 구축하여 살펴보았는데, 이 경우에도 hypoxia/reoxygenation에 의해 과산화되는 Prx III의 환원이 촉진되었고, 세포사멸도 현저히 억제되었다. 즉, 미토콘드리아에 과발현된 Srx가 Prx III의 과산화에 의한 활성저하를 효과적으로 억제함으로써, 미토콘드리아에서 H2O2가 효율적으로 제거되어, 축적된 H2O2에 의한 미토콘드리아 막의 cardiolipin 산화와 막전위차 붕괴 등 일련의 과정을 통한 세포사멸을 억제할 수 있다는 것을 규명하였다. 본 논문에서는 Prx III는 병적 상태에서 생성이 증가되는 미토콘드리아 내 H2O2를 제거하는 중요한 항산화 system임을 규명하였다. Prx III는 미토콘드리아 H2O2가 매개하는 세포 손상을 억제시키는 중요한 인자임에도 불구하고, 미토콘드리아 내에서 산화적 스트레스에 노출되어 쉽게 과산화되어 비활성화될 수 있으므로, 과산화된 Prx III의 기능을 복구하는 세포 내 작용기전의 규명이 요구되었다. 본 논문을 통하여 미토콘드리아로 이동한 Srx가 과산화되어 손상된 Prx III의 복구를 증대시키고, 그 결과 미토콘드리아에서 생성되는 H2O2가 효과적으로 제거되게 함으로써 미토콘드리아 및 세포 내 redox balance를 유지하는데 중요한 인자로 작용한다는 것을 규명하였다.;The mitochondria are the major intracellular source of reactive oxygen species (ROS), which are generated as a natural by-product during cellular respiration. The effects of mitochondrial ROS have been studied for many years in several pathological conditions because ROS could provoke secondary damage. Therefore, levels of mitochondrial ROS are tightly regulated by several physiological antioxidant defense mechanisms. Peroxiredoxin (Prx) III is a member of 2-Cys Prxs, which are a family of peroxidases. Recent studies have emphasized the role of Prx III in the scavenging of mitochondrial H2O2. Prx III is located specifically in the mitochondria and efficiently eliminates mitochondrial H2O2. In this thesis, I examine the cytoprotective role of Prx III and discuss how Prx III is a promising protective regulator of both oxidative stress-induced apoptosis and cellular damage in multiple pathological conditions. In part I, I demonstrate the crucial function of mitochondrial Prx III in the response to hypoxia/reoxygenation-induced oxidative stress in cardiomyocytes. To investigate whether mitochondrial Prx III plays a protective role during hypoxia/reoxygenation, Prx III was depleted in cardiomyocytes using RNA interference (RNAi). Depleting Prx III increased apoptotic cell death of cardiomyocytes compared to control cells. This increase in apoptosis was caused by an increase in ROS generation and cellular damage. These results reveal that hypoxia/reoxygenation accelerates mitochondrial dysfunction and demonstrates that Prx III critically influences a cell’s ability to protect against mitochondrial H2O2. However, Prx III can become overoxidized in the process of eliminating H2O2, leading to a modification of the active cysteine into cysteine sulfinic acid (Cys–SO2H), rendering Prx III inactive. Therefore, in part II of this thesis, I investigate the cellular mechanism that regulates hyperoxidized mitochondrial Prx III. When 2-Cys Prxs are inactivated in vitro, sulfiredoxin (Srx) reduces the cysteine sulfinic acid to cysteine, and Prxs are reversibly reactivated. However, whereas Srx is located in the cytoplasm, Prx III is present exclusively in the mitochondria. Although Srx reduces sulfinic Prx III in vitro, it remains unclear whether the reduction of Prx III in cells is actually mediated by Srx. Gain- and loss-of-function experiments show that Srx is responsible for reducing not only sulfinic cytosolic Prxs (I and II), but also sulfinic mitochondrial Prx III. Moreover, I demonstrate that Srx translocates from the cytosol to the mitochondria in response to oxidative stress. Following these results, I then examine the physiological function of Srx by overexpressing mitochondrion-targeted Srx (mitoSrx). MitoSrx induces the regeneration of sulfinic Prx III and results in cellular resistance to apoptosis. It also enhances the elimination of mitochondrial H2O2 and decreases the rate of mitochondrial membrane potential collapse. Finally, I demonstrate the protective effects of mitoSrx not only on overoxidation of Prx III, but also on mitochondrial ROS-induced cellular damage by stably overexpressing mitoSrx in human embryonic kidney cells (HEK293) and rat cardiomyocytes (H9c2). Collectively, these results suggest that Prx III is an important antioxidant that targets pathology-induced ROS. Even though Prx III is implicated in cytoprotection against ROS-induced cellular damage, Prx III is vulnerable to oxidative stress and can be hyperoxidized and inactivated by severe H2O2 levels. The data in this thesis show that Srx plays a pivotal role in the reactivation of sulfinic mitochondrial Prx III and that the mitochondrial translocation of Srx is critical to maintain the balance between mitochondrial H2O2 production and elimination.