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Generation of Naa20 Null Mutation Mice by Gene Trap

Generation of Naa20 Null Mutation Mice by Gene Trap
Issue Date
대학원 생명·약학부생명과학전공
이화여자대학교 대학원
단백질의 N-α-acetylation 은 단백질 변형의 하나로 진핵생물에서 널리 알려지고 보존되었다. 몇몇의 연구결과를 통해 이러한 변형이 정상세포기능과 암 발달에 관련되어 있음이 밝혀졌다. 포유동물에서는 N-α-acetyltransferase 복합체인 NatA, NatB, NatC 복합체가 주로 N-α-acetylation 기능을 하고 있고, 그 중에서도 NatB 복합체는 효소역할을 하는 Naa20과 보조역할을 하는 Naa25로 구성된다. Naa20은 효모에서 연구가 되어있지만 쥐에서는 거의 알려진 바가 없다. 따라서 본 연구에서는 Naa20의 생체 내 역할을 알아보기 위해 잘 알려진 벡터의 무작위적인 삽입에 의해 knockout 쥐를 만드는 gene trapping 방법으로 Naa20 knockout 쥐를 제작하였다. 현재 International Gene Trap Consortium (IGTC)를 통해 약 135,000개의 gene trapping을 이용한 배아줄기세포주가 밝혀졌는데, 데이터베이스 검색을 통해 ROSAbetageo0 벡터가 Naa20 유전자의 인트론 1에 삽입된 P117A08 배아줄기세포주를 찾았고, 벡터의 정확한 삽입위치를 확인하기 위해 PCR과 sequencing 분석을 진행하였다. 이를 바탕으로 Naa20 knockout 쥐를 제작하였고, 동형접합의 knockout 쥐를 얻기 위해 이형접합의 knockout 쥐를 교배하였으나 동형접합의 쥐는 태어나지 않았다. 따라서 동형접합의 배아가 언제 사라지는지 확인하기 위해 다양한 배아발생시기에 배아의 유전자형을 분석한 결과 마찬가지로 동형접합의 쥐가 태어나지 않는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 Naa20이 정상적인 발생을 하는데 있어 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다. 또한 세포수준에서 Naa20의 중요성을 알아보기 위해 세포 내 위치, 단백질 발현, 세포성장과 관련된 실험을 하였고, 이를 통해 Naa20은 주로 세포질에 존재하고 대부분의 암 세포 주와 정상적인 쥐의 조직에서 광범위하게 발현하며 Naa20의 과 발현은 세포성장을 증가시킨 다는 것을 관찰하였다. 결론적으로 본 연구를 통해 Naa20이 생존에 필수적이며 세포성장에 관련되어 있다는 것을 알 수 있었다.;Protein N-α-acetylation is a conserved and widespread protein modification in eukaryotes. Several studies have linked it to normal cell function and cancer development. In mammalian, protein N-α-acetylation is performed by the N-α-acetyltransferase complexes NatA, NatB, NatC mainly and NatB consists of a catalytic subunit Naa20 and an auxiliary subunit Naa25. Recently, Naa20 has been studied in yeast, but rarely known in mice. Therefore, in this study, to demonstrate the role of Naa20 in vivo, we generated knockout mice through gene trapping that is a method of randomly generating embryonic stem cells with well-characterized insertional vector. About 135,000 trapped ES cell lines are made available to the scientific community by the International Gene Trap Consortium (IGTC; One of its databases identified an ES cell line (P117A08) with a ROSAbetageo-based gene trap vector insertion in intron 1 of Naa20. I have determined the exact insertion point in the trapped ES cell clone P117A08 by PCR analysis and sequencing. Based on this analysis, I have established Naa20 knockout mice line and have crossed with Naa20+/- mice to obtain Naa20-/- mice, but they were not born. Therefore, to identify when Naa20-/- embryos disappear, I have confirmed genotype of embryos in 8.5-11.5dcp, similarly there were not any Naa20-/- embryos. These results indicate that Naa20 plays an essential role that is required for normal development. Furthermore, to verify the importance of Naa20 in vitro, I performed experiments associated with cellular localization, protein expression, cell growth and observed results that endogenous Naa20 is localized in cytoplasm mainly, Naa20 is broadly expressed in most of cancer cell lines and tissues of Naa20+/+ mice and over-expression of Naa20 increases cell growth. Thus I suggest that Naa20 is essential for survival and related to cell growth.
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