Partial Reversal of Mitochondrial Deficit Found in DJ-1 K.O. and PINK1 K.O. Mutant Dopaminergic Neuronal Cell Models

Abstract

Parkinson’s disease (PD) is a common progressive neurodegenerative movement disorder. Specific genetic mutations cause familial PD, which resembles idiopathic PD, most cases of PD. SNCA (alpha-synuclein, PARK1) and LRRK2 (PARK8) mediate autosomal dominant PD and Parkin (PARK2), UCHL1 (PARK5), PINK1 (PARK6) and DJ-1 (PARK7) mediate autosomal recessive PD. Among these genes, Parkin, DJ-1 and PINK1 have been implicated to play an important role in mitochondrial morphology and function. Mitochondrial dysfunction has been suggested as an important pathological mechanism in PD. Therefore, detailed mechanistic studies on the altered mitochondrial function in both animal models and patients of PD will provide us important clues to the development of pharmacological intervention of PD. Owing to having DJ-1 K.O. and PINK1 K.O. cells, mutant dopaminergic neuronal cell models of familial PD, and SN4741 cells, a wild type dopaminergic neuronal cell, any morphological and functional changes incurred by the functional loss of DJ-1 or PINK1 were investigated in mitochondria. First, the structural damages of the mitochondria in DJ-1 K.O. and PINK1 K.O. mutant cells were observed by the electron microscope (EM) studies. Second, the functional deficit in mitochondria was confirmed by the biochemical measurement of ETC (Electron transport chain) enzyme activities, the essential function of mitochondria. In DJ-1 K.O. mutant cells, the activities of Complex I (NADH dehydrogenase) and Complex II (succinate dehydrogenase) were significantly reduced compared to those of the wild type SN4741 cells. In PINK1 K.O. mutant cells, the activities of Complex I, II and especially IV (cytochrome c oxidase) activities were significantly diminished compared to those of the wild type cells. Third, the defective mitochondrial function was confirmed by the measurement of ATP production and O2 consumption. Especially, in PINK1 K.O. mutant cells, ATP production and O2 consumption were significantly decreased compared to those of the wild type and DJ-1 K.O. mutant cells. hAD-MSC cells from the idiopathic PD and Parkin-deficient PD patients also were examined if they have any altered mitochodrial function by using the EM study and biochemical measurement of ETC enzymes activities. In the hAD-MSC cells from the idiopathic PD and Parkin-deficient PD patients, damaged mitochondrial structures and significantly decreased Complex I activitiescompared to those in hAD-MSC from the normal controls were observed. Finally, pharmacological treatments were tested if they help restore the normal mitochondrial functions in the mutant dopaminergic neuronal cells. Treatment with Trolox, an antioxidant, improved significantly the activity of Complex I in DJ-1 K.O. mutant cells and PINK1 K.O. mutant cells. Treatment with a specific purified ginsenoside X, improved significantly the activities of Complex I and IV in DJ-1 K.O. mutant cells and the activities of Complex I, II and IV in PINK1 K.O. mutant cells. In summary, the significant mitochondrial structual damages and functional defects were identified to be involved in the degenerating dopaminergic neurons of the DJ-1-deficient and PINK1-deficient familial PD models and in the hAD-MSC cells established from the idiopathic and Parkin-deficient familial PD patients. Furthermore the treatment of an antioxidant or a purified ginsenoside were demonstrated that they promtes recovery from the mitochondrial dysfucntion in the familial PD.;파킨슨씨병은 진행성 신경퇴행성 질환이다. 가족성 파킨슨씨병은 특정 유전자의 돌연변이가 야기하며 이는 파킨슨씨병의 대부분을 차지하는 특발성 파킨슨씨병과 유사한 형태를 보인다. SNCA (alpha - synuclein, PARK8) 와 LRRK2 (PARK8) 는 상염색체성 우성 파킨슨씨병을, Parkin (PARK2), UCHL1 (PARK5), PINK1 (PARK6) 그리고 DJ-1 (PARK7) 는 상염색체성 열성 파킨슨씨병을 매개하는 것으로 알려져 있다. 이들 유전자 중에서 Parkin, DJ-1 그리고 PINK1은 미토콘드리아 형태와 기능에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 왔다. 미토콘드리아 기능장애는 파킨슨씨병의 병리에서 중요하게 여겨진다. 따라서 동물 모델과 파킨슨씨병 환자에서의 변질된 미토콘드리아 기능에 대한 상세한 기전 연구는 파킨슨씨병의 약물학적 치료 개발에 중요한 단서를 제공할 것이다. 가족성 파키슨씨병 돌연변이 도파민 신경 세포인 DJ-1 녹아웃 세포와 PINK1 녹아웃 세포와 야생형인 SN4741 세포를 가지고 있는 덕택으로, DJ-1과 PINK1의 소실로 인한 미토콘드리아 기능장애에 대해 조사할 수 있었다. 첫째로 전자현미경으로 DJ-1 녹아웃 돌연 변이 세포와 PINK1녹아웃 돌연 변이 세포에서 망가진 미토콘드리아 구조를 관찰했다. 두 번째로 미토콘드리아에 필수적인 전자전달사슬효소 활성을 생화학적 방법으로 측정함으로써 미토콘드리아의 기능 결함을 확인했다. DJ-1 녹아웃 돌연 변이 세포에서 Complex I (NADH 탈수소효소) 과 Complex II (숙식산 탈수소효소)의 활성이 SN4741 야생형 세포에 비해 상당히 감소되었다. PINK1 녹아웃 돌연 변이 세포에서는 Complex I, II 그리고 특히 IV (시토크롬 씨 산화효소) 의 활성이 SN4741 야생형 세포에 비해 상당히 감소되었다. 세 번째로 ATP 생성과 산소소비를 측정함으로써 미토콘드리아의 기능 결함을 확인했다. 특히 PINK1 녹아웃 돌연 변이 세포에서 ATP생성과 산소소비가 야행성인 SN4741세포와 DJ-1 녹아웃 돌연 변이 세포에 비해 감소되었다. 또한 야행성, 특발성 파킨슨씨병 환자 그리고 Parkin 결함 파킨슨씨병 환자에서 유래한 hAD-MSC이 변질된 미토콘드리아 기능을 가지고 있는지도 전자현미경 연구와 전자전달사슬효소 활성 측정을 통해 검사했다. 특발성 파킨슨씨병 환자와 Parkin 결함 파킨슨씨병 환자 유래 hAD-MSC에서 망가진 미토콘스리아 구조와 야행성에서 유래된 hAD-MSC에 비해 상당히 감소된 Complex I 활성이 관찰되었다. 최종적으로 어떠한 약물학적 치료법이 돌연변이 도파민성 신경 세포의 미토콘드리아 기능을 정상적으로 회복시킬 수 있는지 실험했다. 항산화제인 Trolox 처리는 DJ-1 녹아웃 돌연 변이 세포와 PINK1 돌연 변이 녹아웃 세포의 Complex I 활성을 상당히 향상시켰다. 정제된 진세노사이드 Rx 처리는 DJ-1 녹아웃 세포의 Complex I과 IV 활성과 PINK1 녹아웃 세포의 Complex I, II 그리고 IV 활성을 상당히 향상시켰다. 요약하자면, 이 연구는 도파민 신경이 퇴화되는 DJ-1 결함 가족성 파킨슨씨병 모델, PINK1 결함 가족성 파킨슨씨병 모델 그리고 특발성 파킨슨씨병 환자와 Parkin 결함 가족성 파킨슨씨병 환자에서 유래한 hAD-MSC와 관련된 심각한 미토콘드리아 구조적 손상과 기능 결함을 확인했다. 더 나아가 항산화제와 정제된 진세노사이드가 가족성 파킨슨씨병에서의 미토콘드리아 기능장애를 회복을 진전시킨다는 것을 증명했다.