H₂O₂-dependent accumulation of phosphatidylinositol 4-phophate in Golgi

Abstract

Local changes of levels of specific phosphoinositides (PtdIns) are related with modulation of specific signal transductions and physiological functions in specific organelles through recruitment of mediator and effecters which can bind to specific phosphorylated inositol ring. Golgi complex (GC) is shown to have an important role in the sorting and transport of proteins and lipids, secretary vesicle trafficking, lipid biosynthesis and protein modifications. PtdIns-4P is abundant in GC. To visualize the endogenous PtdIns-4P level, we used two PH-domain-containing fluorescent proteins that preferentially bind PtdIns-4P: FAPP1 PH-GFP and OSBP PH-GFP. Upon exposure to low levels of H₂O₂, the levels of PtdIns-4P in GC measured by the GFP probes increased dramatically in Hela, HEK293 and rat aortic smooth muscle cells. The increase could be reversed by exposing the cells to H₂O₂-free medium. The H₂O₂-induced increase of PtdIns-4P level was confirmed by HPLC following the cells with ^(3)H-labelled inositol. Time lap imaging showed that transient increase of ROS by extracellular stimuli (growth factors, cytokines) in A431, MCF7 and RASMCs induced transient increase of PtdIns-4P level in GC. Quantitative analysis of ^(3)H-labelled PIs showed that total level of PtdIns-4P increased dramatically in A431 cells treated with EGF. We found that Sac1, a PtdIns 4-phosphatase, localized predominantly in GC, is oxidetive by exogenous H₂O₂ and endogenous H₂O₂ generated after the EGF stimuli. Also To elucidate functional consequence of increased PtdIns-4P in GC, we transfect HEK293 cells with a vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVG)-GFP vector and applied a temperature change method to monitor protein trafficking. Fluorescence confocal imaging showed that VSVG secretion from GC to plasma membrane (PM) is strongly Increased in H₂O₂ treated cells compared in control group. Based on these results, we propose that the levels of PtdIns-4P in GC increase as the result of H₂O₂-dependent reversible inactivation of Sac1, thereby enhancing protein trafficking from GC to PM.;Phosphoinositide의 국소적인 변화는 세포 소기관의 특이적인 신호전달이나 생리학적 기능조절과 연관되어 있다. 이러한 변화는 이노시톨링의 인산화 상태에 따라 고유하게 결합할 수 있는 mediator나 effector를 끌어들임으로서 진행된다. 세포 내 소기관중의 하나인 골지체는 단백질이나 지질의 이동과 배열, 세포외부로 방출되는 소포나 지질의 합성, 단백질의 변형 등과 같은 현상에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 골지체막에는 특이적으로 많은량의 PtdIns(4)P 함유한다. 우리는 세포가 갖고 있는 PtdIns(4)P를 관찰하기 위하여 PtdIns(4)P에 결합할 수 있는 형광이 달린 vector를 이용하였다. : 두가지 탐침을 이용하여 관찰하였고, 그들은 각각 FAPP1-PH-GFP 와 OSBP-PH-GFP이다. 낮은 레벨의 H₂O₂를 사용하였을 경우, 골지체에서 PtdIns(4)P 가 증가하였으며 이것은 여러가지 세포주(Hela, HEK293, RASMC 등)를 이용하였을 때에도 동일하게 나타났다. 또한 증가된 PtdIns(4)P는 새로운 배지로 갈아주었을 경우, 가역적으로 원래의 수준으로 돌아오는 것을 알 수 있었다. 이미징 결과뿐만 아니라, 정량적인 분석을 위하여 방사성동위원소를 이용한 HPLC분석하였다. 이를 통해 H₂O₂에 의해 유도되는 PtdIns(4)P의 증감을 재확인할 수 있었다. 또한 실시간 이미징방법을 이용하여, 세포성장인자나 사이토카인 자극에 의해 발생되는 세포내부의 H₂O₂에 대해서도 골치체에서 PtdIns(4)P가 일시적인 증가하는 것으로 나타났다. 이러한 현상은 서로 다른 세포주(Hela, HEK293, RASMC 등)들에서 동일하게 관찰되었다. 특히 HPLC분석을 통하여A431세포에서 내피성장인자(EGF)를 처리한 경우를 매우 짧은 시간내에 PtdIns(4)P가 증가되는 것으로 나타났다. 골지체에서의 PtdIns(4)P변화는 골지체의 기능적인 면과 연관이 있다. VSVG 탐침을 통하여 단백질의 이동을 관찰 한 결과, H₂O₂,를 처리한 실험군에서 골지체에서 세포막으로의 단백질이동이 촉진되는 것을 알 수 있었다. 우리의 실험결과에 따르면, 골지체에 위치하고 있는 PtdIns4-phophatase인 SAC1은 H₂O₂에 의하여 촉매활성자리의 cysteine이 산화된다. 즉 산화에 따른 phosphatase activity의 감소가 PtdIns(4)P를 증가시킨 것으로 추측할 수 있다. 이러한 결과들을 바탕으로 H₂O₂의존적이며 가역적인 SAC의 불활성화를 통해 세포내의 PtdIns(4)P를 증가시키고, 이것은 골지체에서 세포막으로의 단백질이동을 촉진한다고 제안한다.