Effects of Resveratrol on Reactive Oxygen Species-mediated Platelet Activation

Abstract

혈소판은 지혈작용, 혈전형성 및 다양한 혈관 질환에서 중요한 역할을 한다. 혈소판이 활성화되면 활성산소종 (ROS, reactive oxygen species)의 생성이 증가되고, 생성된 ROS는 혈소판의 활성화를 촉진시키는 작용을 한다. Resveratrol (RV; 3,4',5-trihydroxystilbene)은 항혈소판과 항산화 효과를 나타내며, RV에 의해서 혈소판의 응집과 ROS의 생성이 억제된다는 보고가 있다. 이런 결과들을 볼 때, RV의 항혈소판 효과는 ROS에 의한 혈소판의 활성화 증폭작용을 억제하기 때문에 나타나는 것으로 생각된다. 그러나, RV와 관련되어 ROS의 조절을 받는 특정 인자 및 이와 관련된 혈소판의 신호전달기전이 아직까지 명백히 밝혀진 바가 없다. 본 연구에서는 혈소판이 활성화될 때 생성이 증가되는 ROS에 의해 매개되는 신호전달기전을 RV가 항산화 효과를 통해 억제시키는 기전에 대하여 밝혀보았다. 이전에 알려진 바와 같이 RV는 collagen에 의해 활성화된 혈소판의 응집 및 ROS 생성을 억제하였다. Protein tyrosine phosphatase (PTP)의 일종인 Src homology region 2-containing protein tyrosine phosphatase-2 (SHP-2)는 ROS에 의해 산화되는 cysteine 잔기를 효소활성부위에 가지고 있다. SHP-2의 cysteine 잔기의 산화를 탐지할 수 있는 PEO-iodoacetyl biotin labeling 방법을 이용하여, collagen에 의해 생성이 증가된 ROS에 의한 SHP-2의 cysteine 잔기의 산화가 RV에 의해서 억제되는 것을 확인하였다. 또한, collagen 자극에 의해 나타나는 Vav1, Bruton’s tyrosine kinase (Btk), Phospholipase Cγ2 (PLCγ2)의 특정한 tyrosine 잔기의 인산화도 RV에 의해 감소되는 것을 확인하였다. 혈소판이 활성화될 때, PLCγ2의 downstream signal로 잘 알려진 세포질 내 칼슘 level의 증가와 혈소판의 표면에 존재하는 integrin αIIbβ3의 활성화도 RV에 의해 억제되었다. 이상의 결과들을 종합해 볼 때, 혈소판이 활성화 될 때 생성이 증가되는 ROS에 의해 SHP-2의 활성부위에 존재하는 cysteine이 산화되어 활성이 저하되는 것을 RV가 항산화작용을 통해 방지함으로써 phosphatase 활성이 유지되도록 함으로써 혈소판의 활성화를 억제하는 것으로 생각된다.;Platelets participate in thrombus formation, hemostasis and various vascular diseases. It has been demonstrated that platelet activation is associated with reactive oxygen species (ROS) production which promotes platelet activation. Previous studies have reported that resveratrol (RV; 3,4',5-trihydroxystilbene) has antiplatelet and antioxidant properties. In this study we observed that collagen-induced aggregation and an increase in intracellular ROS were inhibited by RV. Although it seems that the antiplatelet property of RV is associated with an inhibition of ROS-mediated signaling pathways, the relationship between RV and a direct target of ROS in platelet activation has not been clearly defined. We therefore studied whether RV affects a specific target of ROS and its downstream signaling cascades in collagen-stimulated platelets. One of the redox-sensitive signaling molecules is the family of protein tyrosine phosphatases (PTPs), which contain catalytic cysteine residue vulnerable to ROS-mediated oxidation. It has been known that SH2 domain-containing tyrosine phosphatase-2 (SHP-2) is an important PTP in platelet activation. We observed that the catalytic cysteine residue of SHP-2 was oxidized and this oxidation was significantly inhibited by RV treatment in collagen-stimulated platelets. Simultaneously, the specific tyrosine phosphorylation of various key signaling molecules including Vav1, Bruton’s tyrosine kinase, phospholipase Cγ2 was decreased by RV, potentially through the inhibition of ROS-mediated SHP-2 oxidation. RV also inhibited downstream responses such as an elevation of cytosolic calcium level and the integrin αIIbβ3 activation on the surface of platelets. In conclusion, this study suggests that the antiplatelet effect of RV is resulted from the inhibition of increase in ROS level, the attenuated oxidation or inactivation of SHP-2, and the subsequent downregulation of tyrosine phosphorylation-dependent signaling pathways.