Antofine의 paclitaxel 내성 극복과 TNF-α 유도 암세포 사멸 증강 작용기전 연구

Abstract

Antofine은 박주가리과(Asclepiadaceae) 식물인 산해박(Cynanchum paniculatum)에서 유래한 phenanthroindolizidine alkaloid이다. 이것은 Asclepiadaceae와 Moraceae에만 한정적으로 존재하는 alkaloid로써 항염증 및 강력한 암세포 증식 저해 작용이 있는 것으로 알려졌고, 그 작용 기전으로는 thymidylate synthase와 dihydrofolate reductase 억제, NF-κB와 AP-1와 같은 세포 증식과 사멸을 조절하는 transcription factor들의 transcription activity 저해 등이 알려져 있다. 최근에는 DNA와의 상호작용에 대한 연구보고도 있었으나 현재까지 구체적인 작용기전에 대해서는 많은 연구가 이루어 지지 못한 실정이다. 본 연구에서는 antofine의 paclitaxel 내성 사람 폐암 세포주에 대하여 세포 성장 억제 활성과 내성 극복 기전에 대하여 알아 보았다. antofine은 parent 세포인 A549와 비교해 볼 때 paclitaxel을 지속적으로 처리하여 내성을 획득하게 한 A549-PA 세포에 대해서도 거의 유사한 세포 성장 억제 활성을 보였으며(IC50가 각각 16 nM, 18 nM), 항암제 다제내성의 대표적 원인인 p-gp 발현을 24시간과 48시간에서 모두 저해하였다. 또한 p-gp의 mRNA인 MDR1의 발현 역시 24시간과 48시간에서 모두 저해하는 것을 RT-PCR과 real time RT-PCR을 통해 확인하였다. P-gp의 transporter 기능을 직접적으로 저해 하는지 확인 하기 위하여 rhodamin 123 assay을 수행한 결과 대조군에 비해 세포내에 축적된 rhodamin 123의 양이 증가해 있었으며, antofine 20 nM에서 rhodamin 123의 축적이 최대가 됨을 알 수 있었다. 이 사실을 바탕으로 antofine과 paclitaxel을 병용 처리 할 때 상승 효과를 보이는지 알아보았다. 그 결과, antofine (5, 10, 20 nM) 과 paclitaxel (1.25, 2.5, 5 μM) 의 모든 농도의 조합에서 상승 작용을 나타내었다. 그리고 임상에서 사용되는 기존 폐암치료제와의 병용 시 어떤 효과를 보이는지 알아보았다. 그 결과, gefitinib과는 모든 농도에서 상승 작용을 보였고, erlotinib, gemcitabine과는 가장 낮은 농도에서는 길항 작용을, 나머지 농도에서는 상승효과를 나타내었다. 하지만 sunitinib과의 병용시에는 최고 농도에서만 상가 작용을 나타내었고 나머지 농도에서는 길항 작용을 보였다. 다음으로 사람 대장암 세포주인 HCT116 세포에서 antofine의 작용기전을 연구한 결과, antofine은 단독으로는 apoptosis를 유도 하지 않지만 TNF-α와 병용 시 TNF-α에 의해 유도된 apoptosis를 증강시키는 효과를 보여 주었는데 이는 세포 생존과 관련되어 있는 anti-apoptotic 단백질인 survivin, Bcl-2, Bcl-xl 등의 발현 저해와 그를 통한 caspase의 유도를 통해 이루어 지며, TNF-α에 의해 유도된 강력한 세포 생존 신호 전달 체계인 NF-κB의 transcription activity의 억제, I-κB의 분해 억제를 통하여 나타난 현상임을 알 수 있었다. 또한 affinity based pull-down assay를 통하여 antofine의 표적 단백질을 찾고자 하였는데 peroxiredoxin을 비롯한 여러 종류의 단백질이 분석되었고, 이들에 대해 차후 검증이 필요한 상태이다. 결론적으로 antofine은 A549-PA 내성 세포주에 대하여 강한 세포 성장 억제 활성을 가지고 있는데, 그 이유 중 하나가 p-gp의 과발현을 저해하는 것임을 알 수 있었고, 기존 폐암치료제와의 병용효과도 우수한 것으로 보아 폐암 치료제의 좋은 후보 물질이 될 것이라 여겨진다. 또한 TNF-α와 병용 시 apoptosis 증강 작용을 통한 강력한 암세포 성장 억제 활성을 가질 수 있으며, affinity based pull-down assay의 결과를 검증한다면 antofine의 새로운 작용기전을 밝혀 항암제로의 개발에 기여를 할 수 있을 것으로 여겨 진다.;(-)-Antofine derived from Cynanchum paniculatum Kitagawa (Asclepiadaceae) exhibited a potential growth inhibition against various human cancer cell lines with the IC50 values of low nanomolar ranges. (-)-Antofine belongs to phenanthroindolizidine alkaloids. The mechanism of growh inhibition included the inhibition of DNA, RNA, protein synthesis, inhibition of dihydrofolate reductase activity, and induction of apoptosis. However, the comprehensive study for the investigation of mechanisms of phenanthroindolizidine alkaloids has not been fully elucidated yet. Multidrug resistance (MDR) in cancer is a major obstacle to effective cancer chemotherapy. Expression of P-glycoprotein (P-gp) in cancer cells is highly related to resistance against cancer chemotherapeutic agents. To determine the effect of antofine on the overcome the resistance, we established the paclitaxel-resistant human lung cancer cells A549-Pa by eht gradual increase of paclitaxel with the of IC50 value over 200 times compared to parent A549 cells. An antiproliferative assay using sulforhodamine B revealed that (-)-antofine showed the similar inhibitory effect on the proliferation of A549-Pa cells and A549 parental cells with the IC50 values of 18 and 16 nM, respectively. The inhibitory effect against A549-Pa cells by (-)-antofine was also closely related to the down-regulation of p-glycoprotein expression on A549-Pa cells that overexpress P-glycoprotein. The futher study showed that downregulation of P-gp by antofine was associated with the decreaded expression of its mRNA. The reversal effect of multidrug resistance of (-)-antofine was also evoked by the intracellular rhodamine-123 accumulation in A549-Pa cells. Antofine also exhibited the combinational activity with several chemotherapeutic agents. These findings suggest that (-)-antofine might be a potential candidate as an antitumor agent along with a reversal effect of multidrug resistant cancers. Tumor necrosis factor-α (TNF-α) is a multifunctional cytokine which plays a key role in apoptosis and cell survival as well as inflammation and immunity. The current use of TNF -α in cancer includes the treatment such as locally advanced soft tissue sarcomas and metastatic melanomas. TNF-α also acts synergistically with cytostatic drugs. It is also known that TNF-α can induce apoptotic and necrotic cell death in the absence of NF-κB activation in the majority of cancer cells. On the line, we investigated whether antofine can enhance the TNF-α effect on the apoptotic cell death, and their mechanisms of actions in human colon cancer cell line HCT116. As a result antofine increased the TNF-α induced apoptosis determined by annexin Ⅴ-FITC/PI double staining, DNA fragmentation assay, and poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) cleavage. The possible mechanism of action in the enhancement of apoptosis evoked by TNF-α and antofine might be related with the inhibition effects of antofine TNF-α induced survivin, Bcl-2, Bcl-xL, IAP1 and TRAF2 expressions. Augumentation of caspase-3 and 8 activation and NF-κB inhibition were also potentiation effect of antofine on the TNF-α induced apoptosis. These findings suggested that antofine might be a potential candidate as an antitumor agent. derived from natural products.