Identification of BRCA associated protein-1 and Ran binding protein 9 as human INO80 interacting proteins

Abstract

INO80 complex is a recent member of the ATP-dependent chromatin remodeling complex family. The yeast INO80 (yINO80) complex have been shown to play roles in non-transcriptional nuclear processes such as DNA repair and replication. Our laboratory has recently found that human INO80 (hINO80) is directly implicated in microtubule assembly and chromosome segregation in addition to DNA repair and replication. hINO80 localizes at replication forks overlapping with PCNA during S phase and associates with microtubules during mitosis. Knockdown of hINO80 leads to impaired DNA replication and defective spindle assembly followed by abnormal chromosome segregation. In an effort to understand the mechanisms underlying the functions of hINO80 in such diverse chromosomal processes, our laboratory carried out yeast two-hybrid screening and identified a large number of cellular proteins to interact with hINO80. Among those, I choose four proteins for further investigation, which were the catalytic subunit of SWI/SNF chromatin remodeling complex (BRG1), centrosomal protein 70 kDa (CEP70), BRCA1 associated protein-1 (BAP1) and Ran GTPase binding protein 9 (RanBP9). First, I performed immunoprecipitation experiments and found that, whereas neither BRG1 nor CEP70 interacts with hINO80, BAP1 and RanBP9 both interact with hINO80. Then, I performed immunofluorescence microscopy, and found that BAP1 forms foci overlapping with hINO80 in the nucleus during S phase and that RanBP9 associates with microtubules overlapping with hINO80 during mitosis. These results suggest that BAP1 and RanBP9 work together with hINO80 to function in DNA replication and microtubule assembly, respectively.;INO80는 ATP를 가수분해할 때 나오는 에너지를 이용하여nucleosome의 구조를 바꿀 수 있는 chromatin remodeling complex중에 최근에 밝혀진 family이다. 효모에서 밝혀진 INO80 은 다른 ATP-dependent chromatin remodeling complex 와 마찬가지로 전사조절에 관계 될 뿐 아니라, DNA 이중나선 절단을 복구하는데 있어서도 직접적으로 관련이 있으며 DNA 복제에도 직접 관계한다는 것이 밝혀졌다. 인간의 INO80 는 효모 INO80 와 homology 를 가지고 있으며 실험실에서의 최근 연구를 통해서 정상적인 세포주기 진행과 microtubule assembly 에서 중요한 역할을 할 뿐만 아니라 DNA 복제와 염색체 분리에도 직접적으로 관련이 있다는 것을 밝혔다. 이러한 인간 INO80 기능의 메커니즘은 아직 명확하게 밝혀지지 않았다. 본 논문에서는 인간 INO80 와 결합하는 단백질을 찾기 위해 실험실에서 진행한 yeast two-hybrid screening 을 통해 밝혀진 71개의 유전자 중 BRG1, CEP70, BAP1, RanBP9 의 4 종류 단백질을 선택하여 인간세포 내에서 결합하는지 알아보았다. 먼저 인간세포인 293T 내에서 면역침전반응을 통해 BRG1 과 CEP70 은 인간 INO80 와 결합하지 않는 것을 확인하였고, BAP1과 RanBP9 은 인간 INO80 와 결합하는 것을 확인하였다. 이 결과를 확증하기 위해 면역형광법을 이용하여 세포 내에서 각각의 단백질의 위치를 확인해 보는 실험을 수행하였다. 이 실험을 통해 BAP1 은 S 기 동안 복제 지점에서 인간 INO80 와 겹치는 foci 를 형성하는 것을 확인했고, RanBP9 은 M 기 동안 microtubule 과 인간 INO80 와 결합하는 것을 확인했다. 이 결과는 BAP1 과 RanBP9 은 인간 INO80 와 함께 각각 DNA 복제, microtubule assembly 에 기능 할 것이라는 가능성을 시사한다. 앞으로 좀 더 면밀한 연구를 통해 이러한 단백질이 어떻게 인간 INO80 와 함께 작용하여 DNA 복제, microtubule assembly, 염색체 분리에 작용하는지 밝혀야 할 것이다.