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Single-cell analysis of mitochondrial protein release

Single-cell analysis of mitochondrial protein release
Issue Date
대학원 생명·약학부생명과학전공
이화여자대학교 대학원
NF-κB signaling pathway regulates the expression of target genes that are involved in different cellular response such as cell proliferation, survival and inflammation. A key regulator of all inducible NF-κB signaling pathways is the IKK complex. IKK complex consist of two catalytic subunits, IKKα and IKKβ, and a regulatory subunit, IKKγ, and additional components. Activation of IKK complex leads to target gene expression such as cytokines, SOD2, IAP and Bcl-2 family. Identified the cytosolic hsp60 was previously found as a positive regulator of NF-κB activation by direct interaction with IKK complex. Hsp60 was also released from mitochondria to cytosol under stress/death condition. Here, I show Hsp60 release by single cell imaging. Hsp60 and cytochrome c were tagged with GFP and RFP, respectively. In stress/death stimuli, cytochrome c was released from mitochondria and Hsp60 was also released. The inhibition of cytosolic Hsp60 using antisense ODN led to reduction of IKK phosphorylation. Intracellular ROS level was increased by inhibition of NF-κB target genes expression that triggered the sustained activation of JNK and p38 via ASK-1. Thus, in addition to its chaperone activity, Hsp60 regulates cell survival in cytosol, supporting pro-survival gene expression via NF-κB pathway regulation;NF-κB는 세포 증식, 생존과 염증반응에 관련된 여러 가지 유전자의 발현을 조절한다. NF-κB의 중요 조절자는 IKK complex이다. IKK complex는 두 개의 촉매소단위체인 IKKα, IKKb와 하나의 조절소단위체인 IKKγ 및 추가 구성 요소들로 이루어져 있다. IKK complex가 활성화되면 사이토카인, SOD2, IAP, Bcl-2와 같은 표적 유전자의 발현을 유도한다. 이전 연구에서 세포질에 존재하는 Hsp60이 IKK 복합체와 직접적인 상호작용을 통해 NF-κB의 활성을 유도하는 것을 밝힌 바 있고 스트레스 상황에서 Hsp60은 미토콘드리아에서 세포질로 유도되는 것을 보았다. 이 논문에서는 Hsp60이 방출되는 것을 형광 단백질로 표지하여 하나의 세포단위에서 관찰하였다. 세포 자극 상황에서 cytochrome c뿐만 아니라 Hsp60도 미토콘드리아에서 방출되는 것을 보았다. AS-ODN을 이용하여 세포질 내의 Hsp60을 저해했을 때 IKK의 활성화가 감소하였다. NF-κB 표적 유전자 발현이 억제되어서 세포 내에 활성 산소종의 생성이 증가하였고, 이로 인해 JNK와 p38이 활성화 되는 것을 밝혔다. 따라서 Hsp60은 샤페론 기능뿐만 아니라 미토콘드리아에서 세포질로 방출되어 NF-κB 활성화를 통해 세포 생존을 조절하는 역할을 한다는 것을 알 수 있다.
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