The reduced activity of human nucleoside diphosphate kinase-A through sequential conformation changes induced by oxidation

Abstract

Nucleoside diphosphate kinase (NDPK) catalyzes the transfer of the phosphoryl group from a nucleoside triphosphate (NTP) to a nucleoside diphosphate (NDP) by using ATP as a major phosphate donor through a conserved histidine residue. NDPKs play a primary role not only in maintaining cellular pools of all NTPs but also in the regulation of important cellular processes. NDPK-A (Nm23-H1) acts as a metastasis suppressor for some tumor types. We present here the crystal structure of oxidized human NDPK-A determined at 2.8 A resolution. Since the activity of NDPK-A is decreased during oxidation, the influence of structural changes on enzyme activity has been under questions. Structural comparison of the oxidized form with the native and the ADP bound forms made it possible to elucidate the influence of oxidation on the NDPK activity at the molecular level. The oxidized crystal structure revealed the unexpected disulfide bond between Cys4 and Cys145. This disulfide bridge triggers the dissociation of a large population of the hexameric form into a dimeric form, ascertained by a size exclusion column. During the disulfide formation, approximately 30 A distance shift of the C-terminal domain concomitant with the helix to loop transition occurs. This change again induces the conformational change of the K-pn loop region including two 3_(10-)helices to loops transition, which distorts the backbone geometry of Gly113. The positional change of Gly113 together with a subtle expansion of the solvent accessible surface area of the active site may exert a critical influence on the substrates binding. As a result, the population of the inactive or low active dimeric forms with the severely decreased NDPK activity increases. Therefore, we suggest that the reduced activity of NDPK-A in oxidative condition is closely tied with the conformational changes triggered by the disulfide bond formation between Cys4 and Cys145.;Nucleoside diphosphate kinase (NDPK)는 보존된 histidine 잔기를 통하여 주요한 인산 공여체인 ATP를 주로 사용함으로써 nucleoside triphosphate (NTP)로부터 nucleoside diphosphate (NDP)로 인산기를 옮겨주는 촉매 작용을 한다. NDPK는 모든 NTP의 세포내 적정 수준을 유지시킬 뿐만 아니라 중요한 세포내 작용들을 조절하는 역할을 한다. NDPK-A (Nm23-H1)는 어떤 암 종류에서 전이를 억제한다. 우리는 여기에 2.8 A해상도의 산화된 인간 NDPK-A의 결정 구조를 제시했다. NDPK-A가 산화되면 활성이 줄어들기 때문에 효소 활성에서 구조 변화의 영향이 있는지 의문을 가졌다. 산화된 형태, 본래 형태와 ADP 결합 형태의 구조 비교로 분자적 수준에서 NDPK 활성의 산화가 미치는 영향을 설명하는 것이 가능해졌다. 산화된 결정 구조는 cysteine 4번과 cysteine 145번 사이에 기대하지 않은 disulfide bond가 형성됨을 보여주었다. 이 disulfide 결합은 size-exclusion column에 의해 확인된 것처럼 hexameric 형태에서 dimeric 형태로 분리를 유발한다. Disulfide가 형성된 동안, helix가 loop으로 변하면서 C-terminal이 거의 30 A정도 이동한다. 이 변화는 다시 glycine 113번의 backbone 형태를 비틀면서 K-pn loop 영역의 두 개의 3_(10)-helices가 loop으로 바뀌는 구조적 변화를 유도한다. 활성 부위에서 용매 접근 용이한 표면적의 미묘한 확장과 함께 glycine 113번의 위치의 변화는 기질 결합에 중요한 영향을 미친다. 그 결과, NDPK 활성이 매우 감소된 불활성 또는 낮은 활성의 dimeric 형태가 증가한다. 그러므로, 우리는 산화상태에서 NDPK-A의 감소된 활성은 cysteine 4번과 cysteine 145번 사이에 형성된 disulfide bond에 의해서 유도된 구조적 변화와 밀접하게 연관되어 있다고 제안한다.