Obscurin like 1 (OBSL1) as a negative regulator in NADPH oxidase 4 (Nox4)-mediated ROS generation

Abstract

활성 산소종(Reactive oxygen species, ROS)은 유기호흡을 하는 생물에게 있어 필수적인 산소가 세포 내의 효소 그리고 대부분의 전자 운반 과정 혹은 에너지대사 과정 중에 불완전하게 환원되거나 펩티드 성장인자, cytokine들 및 다양한 작용의 자극에 의해 생성된다. 이 활성산소종은 free radical을 가져 안정되지 못한 상태를 말하며 그로 인해 강한 활성을 가진다. 활성산소종은 생산이 과잉되면 생체에 대해 독성 즉, 산화적 손상(oxidative stress)을 가져온다 하여 유해산소라고 명명되기도 한다. 세포내의 단백질, 지질 등을산화시킴으로써 세포의 항상성을 파괴하고 세포를 사멸시키는 등 세포조직 내에 치명적인 손상을 유발하며, 암, 근이형증, 알츠하이머병, 파킨슨씨병, 허혈성질환, 동맥경화증과 같은 다양한 퇴행성 질병의 원인과 일반적 노화와 관계가 있다. 하지만 연구가 진행됨에 따라 활성산소종이 낮은 농도에 있어서는 세포 내 신호전달 반응에 관여하는 2차 신호전달 물질(second messenger)임이 밝혀졌다. 이러한 2차 신호전달 물질은 오히려 유전자 발현, 세포 성장, 세포 분화, 분비, 세포 이동과 신경전달과정 등의 생리적 반응들을 유도하는 기능을 갖는다. 이러한 활성산소종의 생성 메커니즘은 Neutrophil, monocyte, macrophage와 같은 포식세포에 존재하는 NAD(P)H oxidase 2(Nox2, gp91phox) 의 연구를 통해 밝혀지게 되었다. 이 효소는 두 개의 막 단백질인 gp91phox와 p22phox와 세 개 이상의 세포질 단백질들(p67phox, p47phox, p40phox, Rac1 or 2)로 이루어져 있다. 외부자극이나 병원균의 침입에 의해 세포질 내에 존재하는 단백질들이 인산화효소에 의해 인산화되고 그것은 단백질들 사이의 결합을 유도한다. 그 결과 효소적 활성을 가지는 NAD(P)H Oxidase Complex가 형성되고, 이 complex를 통해 전자의 이동이 일어나 활성산소종이 생성된다. 이렇게 생성된 활성산소종은 포식세포의 면역과정에서 침입한 병원균을 포식세포 내로 함몰하여 죽이는 과정에서 중요한 역할을 하게 된다. NAD(P)H Oxidase Complex를 이루는 구성단백질에 유전적인 돌연변이가 발생했을 때 침입한 병원균을 효과적으로 제거할 수 없게 되고 이는 Chronic Granulomatous Disease (CGD)와 같은 병변상황을 유도한다는 사실은 활성산소종의 중요성을 뒷받침해준다. Nox2의 발견이래로 NAD(P)H oxidase에 대한 활발한 연구가 진행된 결과 포식세포뿐만 아니라 비포식세포에서도 Nox2의 다양한 유사체(Nox1, Nox3, Nox4, Nox5, Duox1, Duox2)가 존재함이 보고되었다. 이 유사체들은 구조상의 유사성에도 불구하고 발현되는 조직이나 효소 활성에 요구되는 보조인자의 종류, 생성하는 활성산소종의 양, 그리고 관련되는 생리학적인 기능 등에서 큰 차이를 보인다. Nox1은 colon조직 및 colon관련 암 세포에, Nox3의 경우는 kidney, liver, lung 등의 fetal tissue에 많이 발현되어 있다고 알려져 있다. 또한 Nox4는 kidney, smooth muscle cells, endothelial cells 등에 과발현되어 있어 있으며, Nox5는 lymphoid organs과 testis에 존재한다. Nox1의 경우 Nox2가 활성산소를 생성하는데 있어서 중요한 보조인자가 동일하게 작용한다는 것과 그 외에도 보조인자의 유사체 (p51phox, p41phox)가 존재하여 그 단백질들에 의해서도 Nox1의 효소활성이 조절된다고 보고되었다. 그러나 Nox4의 경우 Nox2와 Nox1의 활성산소 조절에 관여하는 보조인자 단백질들이 Nox4가 활성산소를 생성하는 과정에 관련되어지지 않는다고 보고 되었으며 그 조절기작이나 구체적인 기능 또한 거의 밝혀지지 않은 상태이다. 다만 보고된 것은 막 단백질인 p22phox가 Nox4가 함께 있을 때 활성산소가 생성되며 이렇게 생성된 활성산소가 노화, 파골 세포의 분화 및 기능조절에 관여한다는 것이다. Nox4의 조절 기전과 생화학적 기능을 규명하기 위해, 우리는 먼저 Yeast two hybrid system을 이용하여 kidney cDNA library를 screening한 결과 Nox4와 결합하는 여러가지 단백질을 찾아내었고, 그 중에 하나가 바로 OBSL1이라는 단백질이다. 이 단백질은 internal cytoskeleton의 안정화에 중요한 역할을 한다고 잘 알려진 obscurin이라는 단백질의 유사 단백질로 발견되었다. Obscurin은 myocyte의 M-band에서 myosin filament를 붙잡고 있는 titin, myomesin과 함께 결합하는 protein이다. OBSL1 또한 이들 두 protein과 결합한다. OBSL1의 기능에 대해서는 거의 알려진 바가 없으나, Ig (immunoglobulin)사이에 Fn3 (fibronectin-like) motif를 포함하고 있는 구조로 미루어 보아, 다른 단백질과 결합하여 세포구조를 안정화시키거나 scaffold signaling complex로 기능하는 cytoskeletal adaptor로 추측되고 있다. 최근 논문에 따르면 CUL7의 mutation이 autosomal-recessive primordial growth disorder (상염색체 열성 원시 성장 장애) 인 3-M syndrome을 야기하는데, OBSL1의 감소가 이러한 CUL7의 downregulation을 유도한다는 것이 밝혀진 바 있다. 또한 OBSL1이 human heart와 skeletal muscle에 많이 발현되어 있는 것을 볼 때, OBSL1의 disruption이 skeletal 이나 cardiac myopathy를 야기할 것이라고 예상되어진다. 이러한 OBSL1 단백질과 Nox4와의 결합을 Yeast two hybrid, GST pull down assay와 co-immunoprecipitation 을 통하여 confirm하였고, 더불어 Nox1, Nox2와의 binding도 확인하였다. Nox4- C terminal의 subdomain들을 이용하여 GST pull down assay 를 수행한 결과, OBSL1은 Nox4의 C terminal region 안에서 NADPH binding domain을 포함하고 있는 P3 domain과 결합하는 것을 확인하였다. 그렇다면 OBSL1과 Nox4와의 결합이 ROS 생성에는 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해 Nox4가 주로 발현되어 있는 HEK293T에서 DCF로 ROS를 측정해보았다. 그 결과 OBSL1이 과발현되면 EGF에 의해 증가되는 Nox4의 ROS 생성이 감소되는 것을 확인하였다. 또한 Nox4가 주로 발현되는 Nox1-/- SMC에서도 PDGF에 의해 증가되는 Nox4의 ROS생성이 OBSL1에 의해 저해되었다. Nox4는 알려진 cytosolic protein은 없으나, ROS생성에 membrane protein인 p22phox와의 결합이 필요하다는 것이 보고된 바 있다. 그렇다면 OBSL1이 Nox4와 p22phox의 결합을 방해함으로써 ROS 생성을 감소시키는 역할을 할 것이라고 추측하였고, 이를 확인해 보았다. 그 결과 OBSL1을 과발현 시켰을 때, Nox4와 p22phox의 결합이 저해되는 것을 Co-IP를 통해 알 수 있었다. 또한 OBSL1을 과발현 시켰을 때의 Nox4와 p22phox의 colocalization을 immunostaining을 통해 보았는데 OBSL1이 없을 때에는 Nox4와 p22phox가 EGF자극에 의해 잘 co-localized 하는 것을 볼 수 있지만 OBSL1을 과발현 시키면 dispersed되는 경향을 보였다. 마지막으로 ROS 생성에는 어떤 변화가 있는지를 확인하여 보았는데, 앞의 결과들에서 예상된 바와 같이 p22phox를 넣어주었을 때 EGF 자극에 의하여 증가되었던 ROS 생성이, OBSL1을 함께 넣어주었을 때에는 자극에 의해서도 증가하지 않음을 확인 할 수 있었다. 위의 결과들을 종합하여 볼 때, OBSL1은 Nox4와 p22phox와의 결합을 방해함으로써 활성산소종의 생성을 조절한다고 예상된다.;Reactive oxygen species (ROS) play crucial roles in various biological processes, such as host defense, signal transduction, and hormone synthesis. Several lines of evidence indicated that cell surface receptor coupled with NADPH oxidase (Nox) in response to agonist resulting in ROS generation. Seven homologs (Nox1, Nox2, Nox3, Nox4, Nox5, Duox1, and Duox2) have been identified in various types of cell. Unlike other members of this family, Nox4 generates ROS constitutively without the need for cytosolic subunits. Moreover, the mechanism by which Nox4 activity is regulated remains unclear. The objective of this study is to identify novel interacting protein which may participate in the regulation of Nox4 activity in terms of ROS generation. OBSL1 (Obscurin like 1) is found as cytoplasmic COOH-terminal region of Nox4-binding protein by yeast two hybrid screening and we hypothesized that OBSL1 may regulate activity of Nox4. GST pull down assay and co-immunoprecipitation assay with COOH-terminal region of Nox4 indicated that OBSL1 binds to NADPH binding domain of Nox4. Over-expression of OBSL1 protein into either HEK293T or Aortic Smooth Muscle Cells (ASMC) results in decrease of ROS generation in response to EGF or PDGF. Integral protein of NADPH oxidase 2 complex, p22phox, is known to be important molecule for Nox4 activity. We analyzed the effect of OBSL1 on interaction of Nox4-p22phox. Expressing OBSL1 resulted in disrupted Nox4-p22phox interaction. Taken together, these results suggest that OBSL1 acts as a negative regulator in Nox4-p22phox complex-mediated ROS generation.