IN-1130, ALK5 저해제에 의한 TGF-β negative regulator 조절작용 연구

Abstract

Transforming growth factor-β (TGF-β)는 다양한 생리활성을 지닌 cytokine으로, 암의 초기 발생단계에서는 암세포의 증식을 억제하는 억제제로 작용하며 후기단계에서는 세포성장 저해 작용은 사라지고 세포 이동성과 전이를 촉진하는 작용을 한다. 실제 유방암 환자에서 TGF-β의 높은 발현은 전이, 생존율 감소와 관련 있다. 따라서 최근 TGF-β pathway 억제를 통한 항암효과에 대한 많은 연구가 진행되고 있다. TGF-β 신호가 하위경로로 전달되는 데는 양성적 조절과 음성적 조절 모두 중요한 역할을 한다. 특히 음성적 조절인자들은 항전이 기전에 영향을 미치며, 전사억제 인자 Ski, SnoN은 TGF-β에 의해 유도되는 전사를 억제하고 Inhibitory Smad인 Smad7은 TGF-β 신호 매개 인자들을 분해함으로 신호를 약화시키거나 종결시키는데 중요한 역할을 한다. 이번 연구에서는 TGF-β typeⅠ수용체(TβRⅠ/ALK5) kinase 억제제로 개발된 IN-1130의 항전이 작용 기전 중 SnoN, Ski 그리고 Smad7의 역할을 알아보고자 BALB/c xenograft 동물 모델과 MDA-MB-231 유방암 세포를 사용하여 실험하였다. MDA-MB-231 유방암 세포에서 Ski, SnoN 단백질은 IN-1130에 의해서 농도 의존적으로 증가하였고, TGF-β에 의해서 현저하게 감소하였다. 유방암 세포에서 Ski, SnoN mRNA는 단백질의 변화와 상관관계가 없었다. BALB/c xonograft 동물 모델에 IN-1130 투여 시 Ski, SnoN 단백질은 대조군과 비교하여 증가하였다. Ski, SnoN 단백질의 증가 기전을 확인해보기 위해서 Proteasome inhibitor을 전처지 한 결과 IN-1130은 Ski, SnoN 단백질의 Proteasome 경로를 통한 분해를 억제하는 것을 알 수 있었다. 또한 TGF-β에 의한 Ski, SnoN 분해에 관여하는 인산화된 R-Smad와 E3 ubiquitin ligase인 Arkadia의 발현을 확인해본 결과, TGF-β에 의해 유도되는 Smad 인산화는 IN-1130에 의해 in vitro, in vivo 모두 현저하게 억제되었고, Arkadia mRNA는 in vitro에서 IN-1130에 의해 유의적으로 억제되었다. IN-1130에 의해 증가된 Ski, SnoN의 전사 억제 작용을 확인하기 위해 ChIP assay를 수행하였다. IN-1130 처치 시 Ski, SnoN 단백질은 TGF-β의 표적유전자인 PAI-1, Smad7, ID1의 promoter에 결합이 증가하였으며, Smad2/3단백질은 TGF-β에 의해 표적 유전자 Promoter에 결합이 증가하였다. Inhibitory Smad인 Smad7은 TGF-β의 표적 유전자로 IN-1130 4시간 처치 시 감소하였으나, 72시간 처치 시 약간 증가하는 경향을 나타냈다. BALB/c xenograft 동물모델에서 농도에 따라 증가하는 경향을 나타냈으며, 그 증가 경향은 TβRⅠ 단백질 발현 감소와 상관관계가 있는 것으로 보여진다. 이번 연구에서 TGF-β type Ⅰreceptor kinase 소분자 억제제인 IN-1130은 TβRⅠ/ALK5를 통한 Smad pathway 억제 작용뿐 아니라 negative regulator 조절을 통한 신호전달 억제 기전이 존재하는 것을 확인하였다. IN-1130에 의해 증가된 negative regulator은 IN-1130의 항전이 효과의 기전 중 하나로 생각된다. 유방암에서 Ski, SnoN 그리고 Smad7의 전이억제 작용을 함께 고려해 볼 때 IN-1130은 효과적인 전이 억제제로 보여진다.;TGF-β is multifunctional cytokine that has dual effects on carcinogenesis. In the early stage of tumors, TGF-β acts as a tumor suppressor by inhibiting cell proliferation. At later stage of tumorigenesis, tumor cells often escape TGF-β mediated growth inhibition and TGF-β promotes tumor invasiveness and metastasis. Thus, anticancer effects through blockade of TGF-β pathway have been spotlighted by a number of researches recently. Positive and negative signals are equally important in controlling TGF-β signaling response. Especially negative regulators affect on anti-metastasis mechanism. Transcriptional co-repressors, Ski and SnoN, inhibit the transcription of TGF-β mediated genes and inhibitory Smad, Smad7, antagonizes TGF-β signal mainly through targeting the signaling receptors. In these studies, we investigated effects of a novel TβRⅠ/ALK5 inhibitor, IN-1130 on regulation of the SnoN, Ski and Smad7 in MDA-MB-231 breast cancer cell in vitro and 4T1 cell xenograft BALB/c model in vivo. In MDA-MB-231 breast cancer cell, Ski and SnoN protein level were increased in dose dependent manner by IN-1130. And they were decreased by TGF-β treatment. Ski and SnoN mRNA did not affect protein level in vitro. Xenograft BALB/c model in vivo, treatment with IN-1130 significantly increased Ski and SnoN protein levels. In order to investigate if these effects of IN-1130 were mediated by proteasomal degradation, MG132 was used and the results showed that IN-1130 inhibited proteasomal degradation of Ski and SnoN protein. And we also examined the expression of Phosphorylated R-Smad and E3 ubiquitin ligase/Arkadia which are involved in TGF-β induced degradation of Ski and SnoN. IN-1130 effectively inhibited Smad2/3 phosphorylation induced by TGF-β in both in vitro and in vivo. The expression of Arkiadia was significantly decreased in basal level by IN-1130 in vitro. To evaluate whether Ski and SnoN affected TGF-β-induced transcription, we performed ChIP assay using MDA-MB-231 cells. Ski and SnoN protein which increased by IN-1130 were bound to TGF-β target gene (PAI-1, Smad7, ID1) promoters. And activated Smad2/3 was bound to these promoters after TGF-β treatment. Smad7 antagonizes TGF-β signaling through a negative feedback loop. In MDA-MB-231 breast cancer cell, IN-1130 decreased Smad7 mRNA in 2hr by antagonized TGF-β signaling but slightly increased Smad7 mRNA in 72 hr. Also IN-1130 increased Smad7 mRNA in BALB/c xenograft models. And the increased Smad7 mRNA was correlated with decreased TβRⅠ protein. Our results suggest that a novel small molecule inhibitor of TGF-β typeⅠreceptor kinase, IN-1130 attenuates TGF-β pathway through not only inhibiting TβRⅠ/ALK5 kinase activity but also regulating negative regulators in MDA-MB-231 in vitro and in BALB/c xenograft model in vivo. The effects of IN-1130 increased negative regulators could be an additional mechanism contributing to IN-1130’s anti-metastasis effects. Considering that effects of negative regulators as well, IN-1130 may be a novel therapeutic agent for metastatic breast cancer.