Mechanism studies of calpain inhibitors discovered through High-throughput screening

Abstract

Alzheimer’s disease는 대표적인 퇴행성 신경 질환으로, AD를 유발하는 대표적인 두 가지 원인은 과인산화된 tau로 이루어진 neurofibrillary tangles (NFT)과 amyloid precursor protein에서 만들어진 amyloid beta protein (Aβ)이다. 이 두 가지 원인 모두에 calpain이 관여한다. Calpain은 calcium 의존적인 cytoplasmic cysteine protease로 정상상태에서 신경 기능에 중요한 역할을 한다. 그러나, insoluble Aβ 등의 영향으로calcium의 항상성이 깨지면 calpain의 과활성 상태가 지속된다. 과활성화된 calpain은 p35같은 다양한 기질을 잘라 신경의 구조와 기능에 영향을 주어 신경 기능 장애를 일으킨다. Calpain에 의해 p35가 p25로 잘려지면서 tau를 과인산화 시킨다. 이러한 이유로, calpain inhibitor 개발은 AD 치료제로서 가망성이 있을 것이다. 한국 화합물 은행에서 분주 받은 6,480개 화합물 중, 독성이 없고 calpain 저해효과가 있는 피마자유 추출물인 UDA를 찾았다. 또한, SAR study를 통해 UDA 유도체 중 calpain 저해 효과가 있는 CLA를 발굴 하였다. UDA와 CLA는 신경 독성에 의한 SH-SY5Y cell의 사멸에서 신경 보호 효과를 나타냈다. UDA와 CLA의 신경 보호 효과 기전을 밝히기 위해 몇 가지 실험을 진행한 결과, UDA와 CLA는 H₂O₂에 의한 free radical 생성을 감소 시켰고 in vitro에서 Aβ의 응집도 저해하였다. 또, UDA와 CLA의 calpain 저해 효과로 cleaved caspase-3, p25와 p-tau의 단백질 level이 감소하였다. 이 연구 결과로 보아, UDA와 CLA의 calpain 저해 효과와 p25을 생성을 감소시켜 Cdk5의 활성을 저해하고, tau의 인산화를 감소로 인한 신경 보호 효과가 있기 때문에, AD 치료제로서의 가능성이 있을 것이다. A. Japonica methanol extract는 calpain 저해 효과가 있었고, glutamate와 H₂O₂에 의한 SH-SY5Y cell의 사멸에서 신경 보호 효과를 나타냈다. 또한, A. Japonica methanol extract는 in vitro에서 Aβ의 응집을 저해하였다. A. Japonica methanol extract는 신경 독성에 의한 SH-SY5Y cell 사멸에서, p25와 p-tau의 level을 감소시켰다. 뿐만 아니라, A. Japonica methanol extract는 항산화 효과도 있었다. A. Japonica methanol extract를 12가지 fraction으로 분리하고, calpain inhibitory activity를 측정한 결과, 1-11번 fraction에서 calpain 저해 효과가 있었다. 또 fraction 11번은 다른 fraction 보다 낮은 농도에서 항산화 효과도 있었다. 앞으로, A. Japonica methanol extract의 1-11번 fraction중 활성물질을 찾고, 신경 보호 효과를 나타내는 기전을 연구할 것이다. 이 연구 결과로 보아, A. japonica methanol extract의 calpain 저해 효과로 인한 신경 보호 작용이 있으므로, AD 치료제로서 가능성이 있을 것이다.;Alzheimer’s disease (AD) is a major neurodegenerative disorder of the aging brain. The characteristics of AD are neurofibrillary tangles (NFTs) comprised of hyperphosphorylated tau and senile plaques made up of aggregated amyloid beta protein (Aβ). Both of the main causes are associated with calpain. Calpains are calcium dependent cytoplasmic cysteine proteases that are essential for normal physiologic neuronal function. However, alteration in calcium homeostasis generated by insoluble Aβ leads to persistent calpain hyperactivation. Hyperactivated calpain cleaves a number of neuronal substrates such as p35 that negatively affect neuronal structure and function, leading to inhibition of essential neuronal survival mechanism. Calpain-mediated p35 cleavage into p25 results in hyperphosphorylated tau. With this reason, the development of calpain inhibitor may serve as a therapeutic target for AD. Among 6,480 compounds provided by Korean Chemical Bank, we found undecylenic acid (UDA) extracted from Ricinus communis L. which was non-toxic and displayed potency of calpain inhibitory activity. Through SAR study, conjugated linoleic acid (CLA) was discovered as a potent calpain inhibitor. UDA and CLA showed neuroprotective effect against neurotoxin-induced apoptosis in SH-SY5Y cells. To study the mechanisms underlying the neuroprotective effect of UDA and CLA, several tests were carried out. UDA and CLA decreased free radical formation induced by H₂O₂ and inhibited in vitro Aβ aggregation. UDA and CLA decreased cleaved caspase-3, p25, and p-tau level at glucose oxidase (GOx)-induced apoptosis in SH-SY5Y cells. The result, observed that UDA and CLA have neuroprotective effect through calpain inhibition, resulting in reduced p25 formation, Cdk5 activation, and tau phosphorylation. UDA and CLA may represent a potential treatment strategy for AD. We also found that Ardisia Japonica methanol extract has calpain inhibitory activity. Ardisia Japonica methanol extract showed neuroprotective effect against glutamate and H₂O₂ induced apoptosis in SH-SY5Y cells. Ardisia Japonica methanol extract inhibited in vitro Aβ aggregation and decreased p25 and p-tau level. Also, Ardisia Japonica methanol extract showed anti-oxidant effect. Ardisia Japonica methanol extract was separated into 12 fractions. All the isolated fractions were tested for calpain inhibitory activity. 1-11 fractions showed calpain inhibitory activity. Especially fraction 11 showed an anti-oxidant effect at low concentration. Further study is planned to identify the active component to discover the mechanism of neuroprotective effect of 1-11 fractions of Ardisia Japonica. The result, observed that Ardisia japonica methanol extract has a neuroprotective effect through inhibition of calpain. Ardisia japonica methanol extract may be another candidate for potential treatment strategy for AD.