A large-scale screening for human methyl-histone binding proteins that function in DNA damage response

Abstract

Recent studies show that histone modifications play important roles in the DNA damage response (DDR) to double strand breaks (DSBs). The best characterized histone modification is the phosphorylation of histone H2AX (γ-H2AX). γ-H2AX forms nuclear foci at the sites of DSBs and triggers the cascades of downstream pathways of DDR. Other histone modifications such as methylation also have been shown to be important for DDR. As a key downstream effector of γ-H2AX, p53 binding protein-1 (53BP1) is recruited to the sites of DSBs via interaction with methylated histone H3 and activates the DNA damage checkpoint. Although the human genome has hundreds of genes encoding proteins with the modules that recognize methylated histones such as chromodomain (CRD) and tudor domain (TDD), few is known about their roles in DDR. In this thesis, I screened for chromodomains that have dominant negative effect on DDR when overexpressed in the cells for the purpose of identifying chromodomain proteins that function in DDR. I constructed the expression vectors for 44 different CRDs and TDDs found in a variety of human proteins. Initially, I tested 21 CRDs including the TDD of 53BP1 as a positive control for their ability to affect the formation of γ-H2AX and 53BP1 foci following DNA damage. First, I confirmed that overexpression of 53BP1 TDD largely compromises 53BP1 foci with slight effect on γ-H2AX foci, indicating that the approach that I used is valid. Then, I found that, among the 21 CRDs tested, the CRD of chromodomain helicase DNA binding protein 2 (CHD2) shows the most significant effect on both γ-H2AX and 53BP1 foci formation. Several other CRDs also showed significant effect on the formation of γ-H2AX and/or 53BP1 foci, with some preferentially affecting 53BP1 foci. Further investigation on these CRDs and the corresponding proteins will substantiate the biological significance of these findings in DDR.;최근의 연구에 의하면 histone modification 은 DNA 이중 나선 절단에 대한 DNA 손상 반응에서 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. Histone modification 중에서 가장 잘 알려진 것은 histone H2AX의 인산화 (γ-H2AX) 이다. 인산화된 H2AX는 DNA 이중 나선 절단 부위에 nuclear foci를 형성하고, 순차적인 DNA 손상 반응을 유도한다. 메틸화 또한 DNA 손상 반응에서 잘 알려진 histone modification 이다. 53BP1은 인산화된 H2AX의 주요한 downstream으로 메틸화된 histone H3와 상호작용하여 DNA 이중 나선 절단 부위로 유도되며 DNA 손상 checkpoint 를 활성화시킨다. human genome 에는 수백 개의 유전자가 chromodomain 이나 tudordomain 과 같이 메틸화된 histone을 인식하는 module 을 가진 단백질들을 암호화하고 있는데, 이 중 몇몇은 DNA 손상 반응에서 기능을 한다고 알려져 있다. 이러한 가설에서, chromodomain 을 포함하는 proteins 이 DNA 손상 반응에서 기능을 하는지 알아보기 위해 chromodomains 를 세포 내에 과 발현 시켰을 때의 dominant negative 영향을 스크리닝 하였다. 새로운 발현 백터를 제작하고 human proteins 에서 총 44개의 chromodomains 와 tudordomain를 찾아 클로닝 하였다. 그 중에서 21개의 chromodomains 을 스크리닝 하였고, 53BP1 의 tudordomain 은 DNA 손상에 의해 유도되는 γ-H2AX 와 53BP1 의 foci 형성에 대한 positive control 로 함께 스크리닝 하였다. 첫째로 53BP1 의 tudordomain 의 과발현이 53BP1의 foci 형성에 큰 영향을 주었지만, γ-H2AX 의 foci 형성에는 미세한 영향을 주는 것을 확인할 수 있었고, 이는 이러한 실험적 접근이 타당하다는 것을 보여준다. 그리고 스크리닝한 21개의 chromodomains 중에서 CHD2의 chromodomain 1 이 γ-H2AX 와 53BP1 의 foci 형성에서 가장 강력한 영향을 주는 것을 확인할 수 있었다. 다른 몇몇의chromodomains 에서도 γ-H2AX 또는 53BP1 의 foci 형성에 의미 있는 영향을 주는 것을 발견할 수 있었다. 이번 스크리닝 결과를 토대로 chromodomains 와 관련된 proteins 를 구체적으로 연구할 계획이다.