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Effects of A₃ adenosine receptor ligands on sAPPα release in human neuroblastoma cells

Title
Effects of A₃ adenosine receptor ligands on sAPPα release in human neuroblastoma cells
Authors
오지연
Issue Date
2010
Department/Major
대학원 생명·약학부약학전공
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Master
Advisors
김화정
Abstract
Adenosine receptor (AR)는 A₁, A_(2A), A_(2B), A₃ 의 4가지 subtypes 으로 이루어져 있고, G protein coupled receptor에 속해 있다. 그 중에서 사람에게 3가지 isoforms로 존재한다고 알려져 있는 A₃AR은 G_(i) 및 G_(q) proteins와 연관되어 adenylate cyclase을 저해하고 phospholipase C, inositol triphosphate와 세포내 Ca^(2+) 반응을 증가시키는 작용을 매개한다. 최근에 A₃AR은 뇌졸증, 암 및 염증와 관련되어 약물 타켓으로 관심을 받고 있다. 그러나 알츠하이머와 같은 신경퇴행성 질환에 대해서는 A₃AR의 역할이 아직 밝혀진 바가 없다. 아밀로이드 전구 단백질 (amyloid precursor protein: APP)은 내재성 막당단백질로서, 대사과정 중 아밀로이드 베타(Aβ)를 생성한다. 정상적인 세포에서 APP의 대사과정 중 작용한 효소중 α-secretase에 의해 절단되어 생성되는 용해성 아밀로이드 전구 단백질 (soluble amyloid precursor protein: sAPPα)은 세포 밖으로 분비되어 세포의 생존, 증식과 부착을 조절하며 신경돌기의 발아 후 생육을 유도한다. 본 연구에서는 A₃AR agonist들이 sAPPα의 분비를 조절함으로서 궁극적으로 AD 치료약물로서의 가능성이 있는지 조사해 보고자 하였고 이를 위하여 A₃AR에 선택적인 agonist들이 인간 신경아세포종 SH-SY5Y 세포에서의 sAPPα 분비에 미치는 영향과 그 세포내 기전을 연구하였다. 먼저 SH-SY5Y 세포에 A₃AR isoforms들이 발현되어 있는지 알아보기 위하여 RT-PCR 실험이 진행되었다. 그 결과 A₃AR isoform 1 유전자는 발현되어 있으나, isoform 2 와 isoform 3은 발현되지 않는 것으로 관찰되었다. 본 실험에서 sAPPα 분비 변화를 조사하기 위해 사용된 네 가지 A₃AR agonist들 중 IB-MECA 와 LJ-529는 현저하게 sAPPα 분비를 증가 시켰지만, Cl-IB-MECA와 LJ-1906은 그다지 큰 영향을 미치지 않았다. 이렇게 각 agonist에 따라 sAPPα 분비에 대해 다른 양상을 나타나는 것은 본 실험에 사용된 세포주에 isoform 1만이 발현되어 있는 사실에 미루어 A₃AR isoforms에 대한 선택성의 차이 때문으로 생각된다. IB-MECA와 LJ-529에 의해 증가된 sAPPα 분비가 A₃AR antagonists에 의해 차단되었으며, 이는 A₃AR을 경유하여 나타난 기능임을 확인시켜 주는 결과이다. AD 환자의 경우 세포 내 Ca^(2+) 항상성의 변화와 관련되어 퇴행성뇌질환 과정이 일어난다고 알려져 있다. 이번 연구에서, 세포 내 Ca^(2+) 반응과 CCE에 의해 A₃AR에 의해 조절되는 sAPPα 변화가 조절되는지 조사하였다. LJ-529는 높은 농도 (50 μM)에서 세포 내 Ca^(2+)을 증가 시켰으나 전형적인 Gq protein 관련 수용체인 muscarinic M3 receptor에 의한 세포내 Ca^(2+) 변화의 양상과는 차이를 보였다. 따라서 본 실험에 사용된 SH-SY5Y 세포 내에서 관찰되는 Ca^(2+) 변화에 A₃AR을 경유한 다른 신호 전달 체계와 관련이 있는 것으로 생각된다. 또한, A₃AR에 의한 sAPPα 분비 조절에 대한 NF-κB가 관련되어 있는지에 대해 조사하였다. 그러나 M3 receptor agonist와는 달리 A₃AR agonist에 의해 증가된 sAPPα 분비가 SN 50을 제외하고 다양한 기전을 갖는 다른 여러 NF-κB 차단제들(BAY 11-7085, Ro 106-9920, MG 132 and PDTC)에 의해서는 조절되지 못하는 것으로 보아 A₃AR에 의해 증가된 sAPPα 분비가 NF-κB 경로와는 직접적인 관련성이 없는 것으로 생각 되며 앞으로의 연구를 통해 더욱 밝혀야 할 것으로 보인다. 본 연구에서는, A₃AR agonists가 신경 보호작용을 나타낸다고 알려진 sAPPα 분비를 증가시킴으로써 AD와 같은 신경 퇴행성 질환들의 치료제로서의 가능성을 제시하였다.;Four adenosine receptor (AR) subtypes, A₁, A_(2A), A_(2B) and A₃, are known and belong to G protein coupled receptor (GPCR). Among them, A₃ adenosine receptor (A₃AR) is known to have three isoforms in human and is coupled to Gi and Gq proteins that mediate the inhibition of adenylate cyclase and the stimulation of phospholipase C, inositol triphosphate and intracellular calcium. Recently, A₃AR has attracted considerable interest as a novel drug target against ischemia, cancer and inflammation. However, the role of A₃AR as a therapeutic target in Alzhiemer’s disease (AD) has not been addressed. The purpose of this study was to investigate whether A₃AR agonist has the potential to be a novel drug target in AD by regulating the release of sAPPα which are known to promote neuronal cell survival. RT-PCR analysis was first performed to examine whether A₃AR isoforms are expressed in SH-SY5Y neuronal cells. The amplified A₃AR isoform 1 fragment was detected whereas amplified fragments of isoform 2 and isoform 3 were not detected in SH-SY5Y cells, indicating that only A₃AR isoform 1 is expressed in SH-SY5Y cells though its expression level is likely to be low. Next, well-known A₃AR selective agonists, IB-MECA and Cl-IB-MECA, and newly synthesized A₃AR selective agonists, thio-Cl-IB-MECA (LJ-529) and thio-IB-MECA (LJ-1906), were tested to investigate their effects on the release of sAPPα in SH-SY5Y cells. The result shows that IB-MECA and LJ-529 increased the sAPPα release significantly. However, there were no significant changes of sAPPα release by Cl-IB-MECA and LJ-1906. The reason for this differential effect of agonists on sAPPα release was not yet characterized, but it could be due to the selectivity of the agonists to the A₃AR isoforms. The sAPPα release enhanced by A₃AR agonists was blocked by the novel A₃AR antagonists, LJ-1251 and LJ-1908, indicating that sAPPα release is regulated by A₃AR activation. Moreover, the involvement of intracellular Ca^(2+) response and the capacitative calcium entry (CCE) in A₃AR mediated increase in sAPPα release was investigated. A₃AR agonist, LJ-529, induced an increase of [Ca^(2+)]i at only high concentration (50 μM) and the increasing pattern of [Ca^(2+)]i was different with other Gq-coupled receptors such as muscarinic M3 receptors. The CCE inhibitors, SKF96365 or Gd^(3+), inhibited of the sAPPα release induced by A₃AR agonists. This data suggest that the release of sAPPα is regulated by A₃AR, possibly via CCE. Finally whether the NF-κB pathway is also involved in A₃AR mediated sAPPα release was examined using NF-κB inhibitors with different mechanisms, including BAY 11-7085 (inhibitor of IκB phosphorylation), Ro 106-9920 (inhibitor of degradation of IκBα S32E, S36E), MG 132 (inhibitor of proteasome activity) and PDTC (copper binding compound that inhibits proteasome activity and IκB phosphorylation). These inhibitors did not block the sAPPα release enhanced by A₃AR-agonist, indicating that the NF-κB pathway may not be a major signaling mechanism for the A_(3A)R-mediated sAPPα release. Results from this study provide a possibility of A₃AR agonists as potential therapeutic drugs for AD in the although detailed cellular mechanisms need to be further elucidated.
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