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Generation and functional analysis of a dominant negative derivative of Sox2

Title
Generation and functional analysis of a dominant negative derivative of Sox2
Authors
서주희
Issue Date
2010
Department/Major
대학원 생명·약학부생명과학전공
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Master
Advisors
김재상
Abstract
이 논문에서 sox2의 dominant negative derivative를 이용하여 sox2의 기능을 분석하기 위해 sox2 HMG box와 Engrailed repressor domain을 fusion시킨 단백질을 이용하였다. 이 fusion단백질은 inhibitory activity를 가져 다른 유전자들의 발현을 조절하는 기능을 가진다. 이 fusion gene은 HIV-1 packing vector Delta 8.9와 VSVG envelope glycoprotein을 co-transfection하여 293 fibroblast에서 만들어진 lentiviral vector, FUW에 삽입하였다. 또한 fusion gene을 retroviral vector로 알려진 LZRS에 넣어 주었다. 이 LZRS는 VSVG protein을 병합하여 recombinant Moloney murine leukemia virus particles를 만들어 숙주 범위를 넓혀주고 생물학적 활동의 손실 없이 100배 정도 적정 농도를 높여 줄 수 있다. 이렇게 만들어진 plasmid를 신경줄기세포로 14주 된 인간의 태아 뇌조직의 피질 영역(cortical region)으로부터 분리한 세포, ReN cell에 분주하였다. Sox2 HMG domain과 Engrailed repressor의해 만들어진 fusion단백질 또한 viral vector system을 이용해 ReN cell에 감염시켰다. 이렇게 Sox2 dominant negative virus를 이용하여 ReN cell과 같은 neural stem cell에 infection하여 neurogenesis를 유도한 후 조절되는 factor를 찾을 수 있는 viral system을 구축할 수 있다. 또한 Sox2 transcription factor에 의해 조절되는 유전자들을 찾을 수 있다.;SRY (sex determining region Y) box2(SOX2) is a transcription factor that is essential for maintaining self-renewal of undifferentiated neural stem cells and suppressing neuronal differentiation. In this project, we utilize a dominant negative derivative of Sox2 to test this function in vitro. Specifically, we generated a fusion protein of the HMG box of Sox2 and the repressor domain of Engrailed. The fusion protein is shown have inhibitory activity on the transcription dependent on the presence of Sox binding element on the reporter plasmids. We have incorporated the fusion gene into a lentiviral vector known as FUW which produced by cotransfecting the HIV-1 packaging vector Delta 8.9 and VSVG envelope glycoprotein into 293 fibroblasts. Also, we have incorporated the fusion gene into a retroviral vector known as LZRS which can be pseudotyped with VSV-G protein and thus be endowed with a broad host range. We plan to use the ReN cells which are human neural stem cell line cells immortalized from 14 week old fetal cortex. Our prediction is that ReN cells will undergo neurogenesis upon expression of the fusion protein. Such results will confirm the role of Sox2 and will allow isolation of target genes of Sox2.
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