한국인에서 MDR3 Promoter 변이 유전자의 기능 검색

Abstract

The liver is the one of major organs responsible for the elimination of drugs and other xenobiotics from the body. Multidrug resistance 3 (MDR3) belongs to the family of ATP-binding cassette (ABC) transporters and it shows 80% amino acid homology with MDR1. MDR3 is present on the canalicular membrane of the hepatocyte and translocates phosphatidylcholine from the inner to the outer leaflet of the canalicular membrane. Because this translocation is the essential process for the excretion of bile acids, it is well acceptable that MDR3 plays an important role on the protection of our liver from bile acids. It has been known that defect of MDR3 gene expression can cause a rare hepatic disease, progressive familial intrahepatic cholestasis type 3 (PFIC3). Other studies found that some genetic variations of MDR3 are associated with hepatobiliary diseases such as drug-induced liver injury, biliary cirrhosis, and obstetric cholestasis. In spite of clinical importance of MDR3 transporter, there is little report to investigate effect of each variant in MDR3 on its expression or function. Most previous studies about functional characterization of MDR3 genetic variations have been restricted to nonsynonymous mutations which were found in PFIC3 patients. Recently genetic variations in the MDR3 promoter region were screened by direct sequencing using DNA samples from a large ethnically diverse population including Koreans and eighteen genetic variations were identified in the same region of MDR3 promoter with our study. However functional characterization of each variant was not performed in the study. In this study, we characterized the transcriptional effects of polymorphic variants or haplotypes in the promoter region of MDR3 that were identified in 126 DNA samples from healthy Koreans. We measured luciferase activities of the four common promoter haplotypes of MDR3 using in vitro reporter assays. The promoter activities of Haplotypes 2, and 3 showed decreased reporter gene expression by 16 and 46%, respectively compared to that of the reference. All variants, such as g.-1584C>T, g.-1031C>T, g.-1014A>G, and g.-495C>G, which are presented in haplotype 3 showed 27-30% decreased promoter activity, compared to that of the reference haplotype. A transcription factor, NF-Y was predicted to bind to the promoter in the region of g.-1584C>T. Result from electrophoretic mobility shift assay showed that the g.-1584C allele exhibited greater binding to NF-Y than the g.-1584T allele. This data suggest that a reduction in the binding affinity with the transcriptional activator, NF-Y, to the MDR3 promoter region may contribute to the reduced transcriptional activity of haplotype 3. Our study suggests that the rate of transcription of MDR3 is regulated by NF-Y and that common promoter haplotype 2 and 3 may affect the expression level of MDR3 in human liver, and ultimately result in variation in drug disposition and response. ;간은 약물 및 생체이물을 체외로 배출하는 데 중요한 역할을 하는 기관이다. Multidrug resistance 3(MDR3)는 ATP-binding cassette (ABC) 수송체 중의 하나로, MDR1의 아미노산과는 80%의 상동성을 보인다. MDR3는 간세포의 세관 막에 높게 발현되며 세포막 안에서 밖으로 포스파티딜콜린을 수송한다. 이러한 수송은 담즙 산의 체외 배출에 필수 과정이므로 결국 MDR3는 담즙 산으로부터 간을 보호하는 역할을 한다. 변이 유전자로 인한 MDR3의 발현 또는 기능 저하는 진행성 가족성 간 내 담즙 정체 증(progressive familial intrahepatic cholestasis) 3형의 주된 원인 인자로 알려졌다. 이외 MDR3의 몇몇 유전자 변이가 약인성 간 손상, 담즙성 간경변증과 임신성 담즙정체증과 같은 간-담즙 관 질환과 관련 있다는 것이 몇몇 선행 연구에서 보고되었다. 위와 같은 MDR3 수송체의 임상적 중요성에도 불구하고 MDR3 변이 유전자에 대한 연구는 아직까지 많이 진행되지 않았으며, 기능을 밝힌 몇몇 선행 연구도 대부분 진행성 가족성 간 내 담즙 정체 증 환자에서 발견된 nonsynonymous SNP에 국한된 것이었다. 최근 한 선행 연구에서 한국인을 포함한 다양한 인종의 DNA 시료를 직접 염기 서열 분석함으로써 MDR3 promoter에 위치한 유전자 변이 및 일배체형의 구조를 밝혔다. 이 연구에서 총 18개의 유전자 변이가 본 연구와 같은 부위의 MDR3 promoter에서 발견되었지만, 각 변이 유전자의 기능을 알아보기 위한 연구는 수행되지 않았다. 본 연구에서는, 건강한 한국인의 126개 DNA 시료를 이용하여 MDR3 promoter 부위에 있는 다형적 유전자 변이 또는 일배체형이 MDR3의 전사에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 먼저 reporter assay를 통하여 MDR3 promoter에 존재하는 4개 주요 일배체형의 promoter 활성을 측정하였다. 그 결과 일배체형2와 3의 promoter 활성이 reference의 활성에 비하여 각각 16, 46%씩 감소하였다. 일배체형3에 포함된 모든 변이(g.-1584C>T, g.-1031C>T, g.-1014A>G, g.-495C>G) 역시 promoter 활성이 reference의 활성에 비하여 27~30% 감소하였다. 전사 인자 결합 위치 분석을 통하여 일배체형3을 구성하는 유전자 변이 중 하나인 g.-1584C>T 부위에 전사 인자인 NF-Y가 결합할 것이라고 예측되었다. 이러한 예측이 맞음을 젤 지연 분석(electrophoretic mobility shift assay)을 통하여 확인할 수 있었으며, 특히 NF-Y가 g.-1584T보다 g.-1584C에 더 잘 결합한다는 것을 알 수 있었다. 궁극적으로 MDR3 promoter 전사에 증폭자로 작용하는 NF-Y에 대한 결합력 감소가 일배체형3의 promoter 활성을 감소시키는 원인 중의 하나라는 것을 알 수 있었다. 본 연구는 MDR3 유전자의 전사가 NF-Y에 의해 조절되며 한국인에서 빈도가 높은 MDR3의 일배체형2와 3이 MDR3의 간 내 발현에 영향을 줄 것이라는 것을 처음으로 밝혔다. 이러한 유전형에 따른 MDR3의 간 내 발현 차이는 궁극적으로는 임상 약물의 약동학 및 약물 반응에 영향을 줄 수 있을 것이다.