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Gene expression analysis and role of TGF-beta 1 and VEGF in the renal pathogenesis of Fabry disease

Title
Gene expression analysis and role of TGF-beta 1 and VEGF in the renal pathogenesis of Fabry disease
Other Titles
파브리병 모델 쥐에서 유전자 발현 분석과 TGF-beta 1 과 VEGF 유전자의 신장에서의 발병 기전 연구
Authors
이미희
Issue Date
2012
Department/Major
대학원 의과학과
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Doctor
Advisors
정성철
Abstract
연구배경: 파브리병 (Fabry disease) 은 알파-갈락토시다아제 A (a galactosidase A, a-gal A) 효소의 결핍에 의해 야기되는 리소좀 축적 질환으로 여러 장기들의 혈관내피 안에 당지질의 일종인 글로보트리아오실세라마이드 (globotriaosylceramide) 인 Gb3가 축적이 됩니다. Gb3의 축적이 진행이 되면 심장혈관, 뇌혈관과 신장조직 등의 기능장애를 일으키게 됩니다. 신장내피세포의 기능장애는 신부전으로 나타나며 파브리병의 주요 증상 중 하나입니다. 그러나 현재까지 내피세포의 기능장애에 의한 발병 기전은 잘 알려지지 않았습니다. 그리하여 본 연구의 목적은 Transforming growth factor-beta 1 (TGF-b1) 과 Vascular endothelial growth factor (VEGF) 두 유전자에 의한 파브리병 신장에서의 발병 기전에 대해 좀 더 알아보고자 하였습니다. 실험방법: 본 연구에서 파브리병 모델 쥐로 a-gal A knockout 쥐를 사용하였습니다. 수컷 쥐는 정상 쥐와 파브리병 쥐 군으로 나누고 각 군은 최소 3마리로 16주령 쥐를 사용하였습니다. 동물 세포주로는 소대동맥내피세포를 사용하였습니다. 마이크로어레이 (Microarray), real-time PCR, 웨스턴 블로팅, caspase-3/-7 그리고 터널 (TUNEL) 실험방법을 사용하여 확인하였습니다. 결과: 마이크로어레이 실험방법은 파브리병의 발병 기전과 관계가 있는 변화된 유전자를 동정하고자 사용하였습니다. 이 실험방법을 통해 정상 쥐와 비교했을 때 파브리병 쥐의 신장조직에서 Thrombospondin-2, -4 (Tsp-2. -4) 와 Neuropeptide Y 유전자 발현이 높았고, 효소 보충 요법 (Enzyme replacement therapy) 을 받은 파브리병 쥐에서 이 유전자들의 발현은 정상화 되었습니다. 파브리병 쥐 신장조직에서 정상 쥐 신장조직보다 TSP-1, TGF-b1, VEGF의 단백질 발현이 많이 발현되는 것을 확인하였습니다. 파브리병 쥐 신장조직에서 VEGF, VEGF receptor 2 (VEGFR2), Fibroblast growth factor-2 (FGF-2) 그리고 인산화-p38의 단백질 발현 양 역시 정상 쥐 신장조직 보다 많이 발현되는 것을 확인하였습니다. caspase-3/-7 활성도 측정과 터널 실험방법을 통해 파브리병 쥐의 신장조직에서 정상 쥐의 신장조직 보다 사멸하는 세포가 더 많다는 것을 확인하였습니다. Gb3를 처리한 소대동맥내피세포 주에서 파브리병 모델 쥐에서와 같이 TGF-b1, VEGF, VEGFR2, FGF-2 그리고 인산화-p38의 단백질 발현 양이 증가하는 것을 알 수 있었습니다. 결론: 파브리병 모델 쥐의 신장에서 TSP-1, TGF-b1, VEGF 그리고 FGF-2 단백질 발현 증가는 혈관 및 신장 병리와 밀접한 결과가 있다고 보여집니다. 이러한 결과는 신장내피의 기능장애에서 TGF-b1 와 VEGF 의 전구-세포사멸 (pro-apoptotic) 로서의 역할을 가능하게 하고 파브리병 신장에서의 발병 기전을 이해하는데 도움이 될 것으로 사료됩니다.;Background: Fabry disease is a lysosomal storage disorder caused by deficiency of a-galactosidase A (a-gal A), resulting in deposition of globotriaosylceramide (Gb3; also known as ceramidetrihexoside) in the vascular endothelium of many organs. Progressive accumulation of Gb3 leads to cardiovascular, cerebrovascular, and renal dysfunction. Endothelial cell dysfunction leads to renal complications, one of the main symptoms of Fabry disease. However, the pathologic mechanisms by which endothelial dysfunction occurs are poorly characterized. The purpose of this study is to investigate the role of transforming growth factor-b1 (TGF-b1) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in the renal pathogenesis of Fabry disease. Materials and Methods: Fabry disease mouse model, a-gal A knockout mouse, were used for this study. Male mice were grouped into wild-type and hemizygotes (Fabry). Sixteen weeks-old mice were used for all experiments. Bovine aortic endothelial cells (BAECs) were used up to passage 7-9 for in vitro study. Microarray analysis, real-time PCR, western blot, caspase-3/-7 and TUNEL assay were performed. Results: Microarray technique was performed to identify altered genes associated with the pathogenesis of Fabry disease. The results indicate that mRNA expression of Thrombospondin-2, -4 (Tsp-2, -4) and Neuropeptide Y were up-regulated in the kidney of Fabry mice compared to wild-type mice and restored in Fabry mice by enzyme replacement therapy. Protein expressions of renal TSP-1, TGF-b1 and VEGF were higher in Fabry mice than wild-type mice. Expressions of VEGF, VEGFR2 (VEGF receptor 2), fibroblast growth factor-2 (FGF-2) and phospho-p38 were increased in the kidney of Fabry mice compared to wild-type mice. Measurement of caspase-3/-7 activity and TUNEL assay indicated that apoptotic cells were higher in the kidney of Fabry mice than wild. In Gb3-treated BAECs, protein expressions of TGF-b1, VEGFR2, VEGF, FGF-2 and phospho-p38 were increased likely to Fabry mice. Conclusions: Up-regulation of TSP-1, TGF-b1, VEGF and FGF-2 may be associated with vascular and renal pathology in Fabry mouse kidney. The pro-apoptotic role of TGF-b1 and VEGF in endothelial dysfunction may accelerate to our understanding of renal pathogenesis of Fabry disease.
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일반대학원 > 의과학과 > Theses_Ph.D
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