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WT1 유전자의 돌연변이 분석과 PDGF-A의 발현에 미치는 영향

Title
WT1 유전자의 돌연변이 분석과 PDGF-A의 발현에 미치는 영향
Other Titles
Mutation Analysis of Wilms' Tumor Suppressor Gene(WT1) and its Effects on Expression of Platelet-derived Growth Factor A-chain (PDGF-A)
Authors
金成珍
Issue Date
1997
Department/Major
대학원 생명과학과
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Master
Advisors
姜順子
Abstract
염색체 11p13에 위치한 Wilms' tumor suppressor(WT1) 유전자는 Wilms 암 발생과정과 더불어 Denys-Drash 증후(DDS)와 관련되여 있다. DDS는 Wilms' tumor traits, genital anomalies 그리고 nephropathy의 증세가 복합적으로 나타나는 질환이며, WT1에 새로운 돌연변이가 발생함으로써 일어나는 것으로 보고되고 있다. 예상되는 WT1 단백질은 전형적인 Cys(2)-His(2) zinc finger 구조를 가지고 있으며, 이러한 구조는 DNA에 결합하여 target 유전자의 전사 과정을 조절하는 transcription factor로서의 기능을 암시한다. 본 연구에서는 DDS 환자의 WT1 분석을 통해, 한국언으로서는 처음으로 exon 8에서의 point mutation을 밝혀냈다. 이 돌연변이는 heterozygous하며, 아미노산 cystein을 serine으로 전환시켰다. 그 결과 단백질의 zinc finger 구조에 치명적언 결함을 가져올 것으로 생각 되었다. WT1의 일반적인 역할은 이의 target 유전자의 발현을 억제하는 것으로 받아들언다. 따라서 환자의 경우와 동일한 형태의 mutant WT1의 기작을 예상해 볼 때, 이의 target 유전자로 가장 잘 밝혀진 platelet-derived growth factor A-chain(PDGF-A)와의 관계에서 이 유전자의 전사를 억제하지 못하여 그 결과 과다한 발현을 보일 것으로 예측 하였다. 이러한 가정을 입증하기 위해, site-directed mutagenesis가 수행되어 인위적인 돌연변이체를 만들었으며, 이를 expression vector에 cloning하였다. 완성된 돌연변이체는 embryonic kidney-derived 293 세포에 도입되었고, RT-PCR을 이용하여 세포 내 mutant WT1의 발현을 확인하였다. 그 결과 예상되는 PDGF-A의 over-expression을 입증하기 위해 RNase protection assay를 실시하였다. 이를 통해 나타난 결과는 mutant WT1의 도입으로 형질 전환된 cell line에서 normal control에 비해 높은 수준의 PDGF-A mRNA가 유도 되었음을 알 수 았었다. 또한 mutant WT1이 같온 수준으로 발현될 wild type WT1과의 경쟁적 관계에서 dominant-negative 효과를 보인 것이라 추측할 수 있다. 결론적으로, DDS는 단지 하나의 대립형질에서 일어난 돌연변이에 의해(heterozygous), dominant-negative 형태의 기작을 통해 발병될 수 있음을 제시한다.;Wilms' tumor suppressor gene(WT1), located at chromosome 11p13, is involved in both Wilms tumorigenesis and also Denys-Drash Syndrome(DDS), which features Wilms' tumor traits, genital anomalies and nephropathy. DDS has been demonstrated to carry de 110VO constitutional mutations in WT1. The predicted WT1 polypeptides show features characteristic of transcription factors especially four contiguous Cys(2)-His(2) zinc finger domains, considered as a DNA binding region. In this study, the first Korean case of DDS was revealed to have point mutation in exon 8, converting the amino acid cystein to serine. Notably, this mutation was heterozygous(only one alleic alteration) and was expected to have an altered DNA binding ability. The general function of WT1 is considered to be a repressor over its target genes. Therefore an obvious question wasif the mutant WT1 could not repress one of the target genes, such as PDGF-A(platelet-derived growth factor A-chain) transcription, which is related to nephropathy and tumorigenesis. To investigate the alteration of the mutant WT1, site-directed mutagenesis was used to construct the expression vector carrying the mutant WT1 cDNA, which was identical with the clinical sample case. Through the stable transfection assay into embryonic kidney-derived 293 cells, elevated levels of PDGF-A mRNA were detected in all the mutant transfectants in RNase protection assay. This results suggested that mutant WT1 gene products could not repress the transcription of PDGF-A as normally. In conclusions, these consequences indicate that the mutation which the patient have is responsible for the up-regulation of PDGF-A and is causally related to the patient's features. Furthermore, only one alleic mutation can be enough requisition for DDS, suggested the pattern of dominant-negative effects.
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