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Characterization of Oxidative Stress Induced Apoptosis in Thermotolerant Cells

Title
Characterization of Oxidative Stress Induced Apoptosis in Thermotolerant Cells
Other Titles
Oxidative stress에 대한 내열성 세포에서의 apoptosis 현상에 관한 연구
Authors
정지영
Issue Date
2000
Department/Major
대학원 분자생명과학부
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Master
Advisors
李公珠
Abstract
Reactive oxygen species (ROS) and free radicals are proposed as mediators in various physiological and pathological processes. Exposure of cells to extracellular ROS initiates a variety of intracellular signaling pathways, which may lead to cell death through apoptosis. Recently, thermotolerance has been shown to protect oxidant-mediated apoptosis. But it is poorly understood how thermotolerance protect all oxidant-mediated apoptosis. And it has been reported that there is only partial overlap in intracellular signaling pathway induce apoptosis by diamide and H(2)O(2). Diamide is a sulfhydryl oxidant, which can denature the proteins by cross-linking, and H(2)O(2) is a nonspecific oxidant. In this study, thermotolerant cells having overexpressed hsps have been adopted to examine the possibility different signaling pathways in response to diamide and H(2)O(2). Radiation-induced mouse fibrosarcoma cell line (RIF-1) and its thermotolerant cell line (TR-RIF-1), having elevated levels of heat shock proteins (hsps), were used to investigate the stress response to H(2)O(2) and diamide. When both cell lines were exposed to various concentrations of diamide and H(2)O(2), TR-RIF-1 was more significantly resistant to diamide than RIF-1, but not to H(2)O(2). Diamide treatment significantly induced hsp70, but H(2)O(2) treatment did not. And the kinetics of SAPK/JNK activation and decay in response to diamide are significantly different between RIF-1 and TR-RIF-1 cells. But no difference in two cell lines was found in response to H(2)O(2). To elucidate the different response of TR-RIF-1 to diamide and H(2)O(2), the suggested molecules involved in the apoptosis were monitored for hsp formation, production of ROI and SAPK activation etc after exposing the cells to both oxidants: The signaling responses were distinguished between two oxidants. Simultaneously, the molecular targets of oxidative stresses were examined by running the non-reducing gel electrophoresis and radio-labeling the cysteine residues in active site with alkylating agent, iodoacetic acid. Oxidative stress of various cells with diamide and H(2)O(2) causes production of high molecular weight Nm23, which is nucleoside diphosphate kinase (NDPK). Transient crosslinking at Nm23 occurred in response to mild oxidative stress and disappeared during cell recovery. In contrast, crosslinking Nm23 obtained thought strong oxidative stress remained during apoptosis. This suggests that Nm23 may be a target of oxidative stress and that disulfide crosslinking of Nm23 may be one of the modifications for cellular regulation. The oxidized proteins in cells exposed to oxidants were identified by labeling the active site Cys with [^(14)C]iodoacetate at pH 6.5. The results show that Cys in active site of glyceraldehyde-3-phosphatedehy drogenase (GAPDH) is a target of oxidants and could be a turn on/off switch for cell death and survival. The cellular signaling mechanism in response to these oxidants should be further studied to understand the apoptosis induced by protein denaturation and ROS formation by growth factor.;최근들어 Reactive oxygen species (ROS)와 free radical은 다양한 생리학적, 병리학적 현상에서 하나의 mediator로써 중요성이 대두되고 있다. 세포에 외부로부터 ROS를 처리한 경우 다양한 세포내 신호전달기전을 유발해 apoptosis를 통해 결국 세포를 사멸하게 한다. 최근 들어 내열성이 oxidant에 의해 유도되는 apoptosis에 저항성을 갖는다고 보고되고 있다. 하지만 내열성이 어떻게 모든 oxidant에 저항성을 가지는지는 잘 알려져 있지 않다. 또한 최근 diamide와 H(2)O(2)의 세포내 신호전달기전이 같지 않다는 보고가 있다. Diamide는 세포내 단백질을 crosslinking 시킴으로써 변성시키는 sulfydryl oxidant이고 H(2)O(2)는 nonspecific oxidant이다. 이러한 이유로 본 연구에서는 hsps가 많이 발현된 내열성을 가진 세포에서의 diamide와 H(2)O(2)에 대한 반응을 연구하였다. 본 연구에서는 mouse fibrosarcoma인 RIF-1과 이를 45℃의 열로 stress를 주고 37℃에서 회복시키기를 여러 번 반복하여 내열성을 갖게 만든 즉 hsps가 많이 발현되어 있는 TR-RIF-1에서의 diamide와 H(2)O(2)에 대한 반응을 비교하는데 초점을 두어 실험을 수행하였다. 두 세포에 다양한 농도의 diamide를 처리했을 때, TR-RIF-1이 세포의 생존률이나 단백질 합성에 있어 RIF-1보다 훨씬 저항성이 큰 것으로 나타났다. 하지만 두 세포에 H(2)O(2)를 처리한 경우에는 두 세포간의 차이가 거의 없었다. 이러한 diamide와 H(2)O(2)에 대한 반응이 다른 원인을 알아보기 위해서 apoptosis에 관련된 다양한 molecule들을 살펴보았다. 그 결과 두 oxidants에 의해 모두 세포내 ROS는 생성되지만 diamide는 hsp70을 발현시키고 세포를 회복시키는 동안 TR-RIF-1에서 SAPK/JNK의 활성화가 RIF-1 보다 빠르게 감소하는데 반해H(2)O(2)는 hsp70을 거의 발현시키지 않았고 두 세포간의 SAPK/JNK의 활성화에 별 차이가 없었다. 또한 oxidative stress의 molecular target을 연구하는데 있어 non-reducing gel electrophoresis를 전개시키거나 alkylating 물질인 iodoacetic acid를 단백질의 활성화 부위의 Cys 잔기를 radio-labeling 시키는 방법을 수행하였다. 그 결과 diamide와 H(2)O(2) 모두 다양한 세포에서 NDP kinase인 Nm23을 high molecular weight를 시켰다. 또한 이러한 현상은 stress 정도와 관련이 있어 약한 stress에 의해서는 Nm23이 일시적으로 high molecular weight로 되어 세포를 회복시키는 동안 다시 monomer 상태로 되돌아온 반면 강한 stress에 의한 high molecular weight Nm23을 지속적으로 남아 있었다. 이는 Nm23이 oxidative stress의 하나의 target 물질이고 Nm23의 disulfide crosslinking이 세포신호전달을 조절하는 하나의 modification의 일종이라고 생각되어진다. 하지만 Nm23이 high molecular weight이 되는 것이 다른 molecule과 erosslinking 되어서 인지 Nm23만의 aggregation인지는 더 연구되어져야 할 부분이다. Oxidants에 의해 세포내에서 산화되는 단백질은 pH 6.5에서 [^(14)C]iodoacetic acid로 labeling함으로써 확인하였다. 그 결과 glycolysis 효소인 GAPDH의 활성화부위에 있는 Cys이 가역적으로 산화되는 것을 알 수 있었고 그것은 GAPDH의 활성화와도 관련이 있는 것으로 확인되었다. 이것은 최근 apoptosis와 관련되어 활발히 보고 되고있는 GAPDH가 oxidative stress와 관련된 세포 신호전달기전을 조절하는 것으로 생각되어진다. 하지만 growth factor에 의한 ROS 생성과 단백질 변성에 의한 apoptosis를 이해하기 위해서 이러한 oxidants에 의한 세포신호전달 기전은 더욱 연구되어야 할 것이다.
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