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타액선세포에서 protein kinase C에 의해 조절되는 세포 내 칼슘 저장고의 규명

Title
타액선세포에서 protein kinase C에 의해 조절되는 세포 내 칼슘 저장고의 규명
Other Titles
IDENTIFICATION OF INTRACELLULAR Ca^(2+) POOLS REGULATED BY PROTEIN KINASE C IN SALIVARY ACINAR CELLS
Authors
金允珠
Issue Date
1998
Department/Major
대학원 생물과학과
Keywords
타액선세포protein kinase C칼슘저장고
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Master
Abstract
Ionized calcium (Ca^(2+)) is the most common signal transduction element in cells from bacteria to specialized neurons. Stimulation of surface membrane receptors that are coupled to activation of phospholipase C (PLC) induces an increase in cytosolic free Ca^(2+) concentration ([Ca2^(2+)]_(i)), resulting from Ca^(2+) release from intracellular Ca^(2+) stores followed by Ca^(2+) entry across the plasma membrane. Stimulation of PLC also generates 1,2-diacylglycerol which activates protein kinase C (PKC) that provides negative feedback control of [Ca^(2+)]_(i). We have recently reported that the staurosporine, a potent inhibitor of PKC, mobilized Ca^(2+) from IP_(3)-independent intracellular Ca^(2+) pools in rat submandibular acinar cells. In this study, I have studied the nature of the Ca^(2+) pool which is responsible for the staurosporine-induced increase in [Ca^(2+)_(i), and investigated whether the effect of staurosporine is exerted through the inhibition of PKC. In order to measure [Ca^(2+)]_(i) and mitochondrial membrane potential, cells were loaded with fura-2 and rhodamine 123 respectively. Since mitochondria have been known to relase Ca^(2+) to cytosol by the depolarization of mitochondrial membrane in a variety of cell types, we have first investigated whether mitochondria were involved in the staurosporine-induced [Ca^(2+)]_(i) increase. Although 5 μM carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP), proton carrier, rapidly depolarized membrane potential of mitochondria, FCCP increased [Ca^(2+)]_(i) only slightly in the absence of perfusate Ca^(2+) after 10 μM carbachol (CCh) stimulation. In addition, staurosporine did not depolarize membrane potential of mitochondria. These results suggested that mitochondria were not involved in the staurosporine-induced [Ca^(2+)]_(i) increase. Another possible source of Ca^(2+) is secretory granules because they have been reported to contain high concentration of Ca^(2+) in exocrine tissues. To investigate whether secretory granules were responsible for the [Ca^(2+)]_(i) increase during the stimulation with staurosporine, cells were exposed to 100 nM ionomycin followed by 10 μM monensin in the absence of perfusate Ca^(2+) after CCh stimulation. Ionomycin did not release Ca^(2+) from acidic pools such as secretory granules until monensin was added to collapase H^(+) gradient. By contrast, subsequent addition of ionomycin and monensin did not increase [Ca^(2+)]_(i) when cells were pretreated with 200 nM staurosporine. On the other hand, the increases in [Ca^(2+)'], were mimicked by other PKC inhibitors such as K252a, chelrythrine, H-7 and calphostin C. In addition, when cells were pretreated with phorbol 12-myristate 13-acetate, an activator of PKC, staurosporine-induced increase in [Ca^(2+)]_(i) was greatly reduced and delayed. Therefore these results suggest that staurosporine mobilizes Ca^(2+) from IP_(3)-independent, acidic intracellular Ca^(2+) pools by inhibition of PKC in rat submandibular acinar cells.;세포 내 유리칼슘 (ionized calcium, Ca^(2+))은 세포 내 기능을 다양하게 조절하는 신호전달체계의 매개체이다. 타액선세포는 세포막의 수용체가 자극되면 일련의 inositol 1,4,5 trisphosphate (IP_(3))에 의존적인 과정을 거쳐 세포내 칼슘 농도가 증가되고, 세포의 첨단막 (apical pole)에 존재하는 Ca^(2+)-activated Cl^(-) channel이 열리면서 전해질과 물이 도관 내로 이동하여 타액이 분비된다. IP_(3)에 의존적인 세포 내 칼슘 동원경로는 IP_(3) 수용체를 가진 칼슘 저장고인 소포체로부터 칼슘이 유리되거나, 세포막의 칼슘 통로를 통해 세포 외부로부터 칼슘이 유입된다. 그런데 최근 본 실험실에서 IP_(3)에 의존적인 세포 내 칼슘 동원경로를 모두 차단한 상태에서 protein kinase C (PKC)의 강력한 억제제인 staurosporine에 의해 세포 내로부터 칼슘이 유리되는 것을 확인하였다. 이러한 실험 결과를 근거로 본 논문에서는 IP_(3)에 비의존적으로 staurosporine에 의해 세포 내 칼슘 농도를 증가시키는 새로운 칼슘 저장고를 밝히고, staurosporine의 세포 내 칼슘 증가 효과에 대한 PKC의 관여여부를 확인하고자 하였다. 흰쥐 수컷의 악하선에서 선세포를 분리하여 rhodamine 123과 fura-2를 세포 내에 축적시킨 후, 악하선세포를 perifusion chamber에 넣고 표준용액을 관류시키면서 미토콘드리아 막전압과 세포 내 칼슘농도를 측정하였다. 우선 IP_(3)에 비의존적인 칼슘 저장고로 미토콘드리아를 확인해 보았는데, 미토콘드리아는 미토콘드리아 막의 탈분극으로 칼슘을 유리한다는 보고가 있으나 타액선세포에서는 staurosporine에 의해 미토콘드리아 막이 탈분극되지 않았을 뿐 아니라 미토콘드리아를 5 ㎛ carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenyl hydrazone (FCCP)로 탈분극시켰을 때에도 매우 적은 양의 칼슘만이 유리되었기 때문에 staurosporine에 의한 IP_(3)에 비의존적인 세포 내 칼슘 증가 현상과는 무관한 것을 확인하였다. 다음으로는 분비조직에 가장 많이 분포하는 분비과립 (secretory granules)을 확인하였는데, 이는 내부가 산성을 띠고 있어 ionomycin과 monensin을 함께 투여하였을 때 칼슘을 유리한다. IP_(3)에 의존적인 칼슘 동원 경로로부터 칼슘이 모두 유리된 후에, ionomycin과 monensin을 함께 투여하였을 때 세포 내 칼슘 농도가 크게 증가되었으며, staurosporine으로 세포 내 칼슘을 증가시킨 후에는 ionomycin과 monensin에 의해 더 이상 세포 내 칼슘이 증가되지 않은 것으로 보아 ionomycin과 monensin에 의해 칼슘을 유리하는 칼슘 저장고로부터 staurosporine이 칼슘을 유리한 것임을 확인하였다. 또한 staurosporine 외에 다양한 PKC 억제제와 PKC 활성제를 투여하여 PKC의 관여여부를 확인하였는데 그 결과 staurosporine을 투여하였을 때와 같은 조건에서 다양한 PKC 억제제에 의해 세포 내 칼슘 농도가 증가되었으며, PKC 활성제를 전처치한 후에 staurosporine을 투여하였을 때는 칼슘 농도의 증가가 크게 억제되었다. 이상의 결과들로 미루어 staurosporine에 의해 세포 내 IP_(3)에 비의존적으로 칼슘 농도가 증가되는 현상은 세포 내 산성을 띠는 칼슘 저장고로부터 유래한 것이고, staurosporine에 의해 칼슘이 유리되는 과정이 PKC를 억제함으로써 이루어진 결과임을 알 수 있었다. IP_(3)에 의존적으로 세포 내 칼슘 농도를 증가시키는 경로인 소포체와 세포막의 칼슘 통로를 통한 칼슘 유입 외에 staurosporine에 의해 IP_(3)에 비의존적으로 세포 내 칼슘 농도를 증가시키는 새로운 칼슘 저장고와 PKC의 관계는 앞으로 연구하여야 할 과제로 생각한다.
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일반대학원 > 생명·약학부 > Theses_Master
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