Streptomyces sp.264로 부터 제한효소의 분리정제 및 성질에 관한 연구

Abstract

토양에서 분리된 방선균 약 30여 균주를 대상으로 제한효소의 유무를 조사하여 No.264에서 제한효소의 활성을 발전할 수 있었다. 이 No.264 균주의 특성을 조사한 결과 방선군의 세포벽 주요성분인 L,L-DAP,Glycine, Glutamic acid, Alanine을 함유하고 있어 streptomyces 속에 속하는 균주로 동정되었다. 30℃ 에서 48시간 동안 배양한 방선균의 균체량 약 15g 을 head beater로 파쇄하여, Streptomycin sulfate 침전, Ammonium sulfate 침전, Hydroxylapatite column chromatography, Sephacryl S-200 HR column chromatography, Hydroxylapatite column chromatography 의 과정을 거쳐 정제하였고 0.1 % SDS를 포함하는 polyacrylamide gel에서 전기영동한 결과를 토대로 분석한 결과 subunit의 분자량은 약 35,000 dalton으로 추정되었다. 이 효소의 촉매적 성질은, pH 7부터 pH 12.5의 알칼리 pH 범위에서 안정하였고, 60℃ 까지 활성을 보였으며, 온도 안정성은 20℃ 에서 60℃까지 안정한 것으로 나타났다. 또 이 효소는 0-500mM 까지의 고 농도의 NaCl에서도 활성이 나타났고, Mg^(2+) 를 cofactor로 필요로 하였으며, 2-mercaptoethanol을 500mM 까지 첨가시 계속 활성을 보였다. 이 제한효소는 lambda DNA, pBS(Blue Script)를 한 곳에서 인지하였고, lambda DNA를 double digestion하여 제한효소 지도를 작성한 결과 Xho I과 isoschizomer 인것으로 보인다. ; About thirty bacterial strains of actinomycete isolated from the soil were examined for the presence of restriction endonuclease activity. No. 264 strain was found to contain restriction endonuclease activity. Therefore the purification of this enzyme was carried out via streptomycin sulfate precifitation followed by ammonium sulfate fractionation followed by hydroxylapatite column chromatography followed by sephacryl S-200 HR column chromatography followed by hydroxylapatite column chromatography using 15 g of cells. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis resulted in 35,000 dal tons protein purified from various column choromatography. In catalytic properties, purified restriction endonuclease was stable at wide range of pH between 7.0 and 12.5 and active up to 60℃ and 500mM NaCl. It is stable between 20℃ and 60℃, purified restriction endonuclease essentially require MgCl_(2) for endonuclease activity. Purified restriction endonuclease seems to cut lambda DNA and pBS one, the restriction map of lambda DNA was obtained by double digestion of various enzymes.