Streptomyces sp. 58로 부터 제한효소의 분리정제 및 성질에 관한 연구

Abstract

30 여개의 방선균 균주를 대상으로 제한효소의 유무를 조사하여 한 균주 방선균 58 로 부터 새로운 제한효소의 활성을 발견하였다. 그리하여 이 방선균 58로부터 생산되는 제한효소를 분리정제하여 그 촉매적 특성에 대해 조사하였다. 효소의 정제는 균체를 bead beater 로 파쇄한 후 Streptomycin sulfate 침전, DEAE cellulose column, Hydroxylapatite column, Phosphocellulose Pll column chromatography 과정을 통해 정제하였고 0.1% SDS 를 포함하는 polyacrylamide gel electrophoresis로 분자량을 조사한 결과 약 50,000 dalton 이었다. 이 효소의 촉매적 성질을 살펴보면, pH 7 에서 pH 10 사이의 영역에서 안정하였고, 적정 반응 온도는 30-37℃ 였고 온도 안정성은 25-45℃ 사이로 나타났다. 이 효소는 20mM이상 40mM하의 MgCl_(2)에서 활성을 나타내고 20mM MgCl_(2)이하에서는 부분 절단만 나타내며 25 mM 이상의 NaCl 에서 활성이 저해되었으며, DTT는 100mM 까지 첨가해도 계속 활성을 나타냈다. 이 효소는 lamda DNA 외에 pBS(Bluescript)을 절단할 수 있었다. lamda DNA를 이용하여 제한효소지도를 작성하였다. ; Thirty Streptomyces sp. strains isolated from soil collected samples wer screened for the presence of site specific endonuclease. One strain showe endonucleasee like activity to cleave lamda DNA. This study describe purification and characterization of a new site specific restrictio endonuclease from Streptomyces sp. strain. The purification procedure includes streptomycin sulfate treatment, DEAE-cellulose column, hydroxylapatite column, phosphocellulose column chromatography, and SDS polyacrylamide gel electrophoresis. This enzyme requires high Mg^(2+) concentration(20-40mM), and shows maxima activity at neutral pH(7-8) in the abscence of NaC1. This enzyme does no require salt for enzymatic action, but it requires DTT for enzyme activity and it activity was inhibited by over 75mM NaCl, and was optimum between 3 ℃and 37℃, and its thermal stability is between 25℃ and 45℃. Since this enzyme cuts lamda DNA and plasmid pBS(Bluescript). th restriction map of lamda DNA was made by double digestion of variou enzymes. As a result SehI cuts lamda DNA at 4 sites.