Overexpression of hARD1235 Accelerates Tumorigenesis in ApcMin/+ Mice via Acetylation of β-catenin

Abstract

Arrest defective 1 (ARD1) 은 Yeast에서 cell cyle에 관여하는 것으로 처음 보고되었으며, N-acetyltransferase의 활성을 가진 효소이다. ARD1은 alternative splicing에 의해 다양한 isoform들을 가지게 되는데 쥐에서는 ARD1225, ARD1235 인간에서는 ARD1235가 기능을 가진다. 쥐에서 밝혀진 ARD1225의 경우, 저산소 상태에서 암세포의 성장과 발달에 중요한 전사인자인 Hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α)의 안정성을 저해하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 반면 C 말단의 아미노산 서열이 다른 ARD1235 의 경우, HIF-1α의 안정성을 조절하는 것에 큰 영향을 미치지 못하며 몇 가지 인간의 암에서 높은 발현을 나타내는 것으로 알려졌다. 또한 hARD1235는 세포 증식과 관련된 전사인자인 β-catenin을 아세틸화하여 활성화시킨다는 세포 수준의 연구가 보고된 바 있다. 본 연구에서는 암의 발달과 조절에 관련된 ARD1235의 생체 내 기능에 대해 알아보고자 하여 우선 hARD1235가 발현하도록 하는 벡터를 제작하였고, hARD1235가 과발현하는 형질 전환 쥐를 만들었다. 온 몸에서 ARD1235가 과발현 하도록 제작된 이 쥐의 경우, 각 조직에 따라 β-catenin의 발현을 관찰한 결과 정상 쥐와 비교하여 장에서 β-catenin이 높게 발현하는 것을 알 수 있었다. 또한 암의 발달에 관련된 hARD1235의 역할을 알아보고자 대표적인 대장암 동물모델로 알려진 ApcMin/+와 교배하여 hARD1235가 과발현하는 ApcMin/+ 쥐를 만들었다. 그 결과 hARD1235가 과발현하는 ApcMin/+ 쥐의 경우, ApcMin/+ 쥐에 비해 장에 형성된 종양의 수와 크기가 증가하는 것을 관찰하였다. 이러한 결과를 바탕으로 hARD1235의 β-catenin 조절 기작에 대해 알아보고자 세포 수준의 실험을 수행하였다. 그 결과, 세포 내에서 mARD1225와 hARD1235는 모두 β-catenin과 결합하며 β-catenin의 발현을 증가시킴을 관찰할 수 있었다. 또한 mARD1225와 hARD1235는 β-catenin을 아세틸화하며, 특히 hARD1 235 의 경우 mARD1225과 비교하여 β-catenin의 아세틸화에 더 큰 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 hARD1235가 과발현하는 ApcMin/+ 쥐의 종양에서 β-catenin의 발현이 ApcMin/+ 쥐의 종양에 비교하여 높게 발현함을 통해 확인되었다. 결론적으로 본 연구를 통해 hARD1235가 β-catenin을 아세틸화 함으로써 β-catenin의 발현을 증가시키고, ApcMin/+ 쥐의 장에서 이러한 β-catenin의 축적이 종양의 형성과 발달을 가속화 한다고 생각된다. 따라서 ARD1의 β-catenin 조절에 대한 연구를 통해 β-catenin에 의해 조절되는 암 발달 기작을 이해하는데 중요한 실마리를 제시할 수 있을 것이다.;The Arrest Defective 1 (ARD1) was first described as an N-acetyltransferase involved in cell cycle control in Saccharomyces cerevisiae. ARD1 has diverse isoforms derived from alternative splicing at exon Ⅷ. mARD1225 and hARD1235 have the functional effect in mice and only ARD1235 has the functional effect in human. ARD1225 has turned out to destabilize Hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) which is important transcription factor of tumor development in hypoxia condition. In contrast, hARD1235, which has different C-terminal amino acid sequences, is not involved in the regulation of HIF-1α stability and has been shown to be highly expressed in several human cancers. In addition, hARD1235 is revealed to acetylate and activate β-catenin involved in cell proliferation. In this thesis, I constructed the hARD1235 expression vectors and established transgenic mice overexpressing hARD1235 in whole body to study the in vivo function of hARD1235. In hARD1235 transgenic mice, the level of β-catenin expression was significantly increased in intestine compared to in wild type mice. In addition, to discover the function of hARD1235 which is related to tumor development, hARD1235 transgenic mice were cross-bred with ApcMin/+. The number and size of intestinal tumors increased in ApcMin/+/hARD1235 transgenic mice compared to the ApcMin/+ mice. Based on these results, I performed experiments to elucidate the mechanisms by which ARD1 regulates β-catenin. I found that mARD1225 and hARD1235 bind to β-catenin and increase the levels of their expression. In addition, both mARD1225 and hARD1235 acetylate β-catenin, with hARD1235 more effective than mARD1225. These results are in keeping with the observation that the expression of β-catenin is increased in ApcMin/+/hARD1235 transgenic mice compared to ApcMin/+ mice. In conclusion, this study shows that hARD1235 acetylates β-catenin and increases the expression of β-catenin. It also shows that accumulation of β-catenin leads to the increase of tumor formation and development in intestine of ApcMin/+/hARD1235 transgenic mice. Therefore my findings of the β-catenin acetylation by hARD1235 will provide an important clue to understand the mechanisms of β-catenin-driven cancer development.