ATM phosphorylation of BRG1 chromatin remodeling enzyme in response to DNA damage

Abstract

DNA 이중 나선 절단 (DSBs) 이 일어나면, 신호전달 체계가 활성화되고 세포 주기의 정지, DNA 손상 치유 과정으로 이어지게 된다. PI3 kinase family의 하나인 ATM은 DNA 손상에 대한 반응에서 많은 checkpoint들을 가동시키고 치유 단백질들을 활성화 시키는 등의 중요한 역할을 한다. 이전 연구에서 SWI/SNF chromatin remodeling복합체의 촉매적 기본구성단위인 BRG1이 DNA 절단 부위에 있는 H2AX 히스톤 단백질의 인산화를 촉진시킴으로써 DNA 손상 치유 과정에 직접적으로 참여한다는 사실이 밝혀진 바 있다. 본 논문에서는 DNA 손상에 따른 과정에서BRG1이ATM에 의해 인산화 되는 지를 조사하였다. 먼저, 2 차원의 젤 분석을 통해 DNA손상의 한 종류인 방사선을 쬐고 난 후 BRG1이 인산화되는 것을 보았다. 한편으로 GST가 결합되어 있는BRG1과 hBrm에 SQ 모티프가 포함되어 있는 단편을 제작하여 단백질을 정제하였다. 또한, 각각 다른 부위의Serine 잔기를 Alanin으로 치환한 단백질도 정제하였다. 정제한 단백질들은 면역침강법으로 얻은 ATM과 함께kinase 분석에서 사용되었다. 그 결과 ATM에 의해서 Ser 721이 인산화된 것을 밝혔다. 다음으로, Ser 721의 인산화를 인지하는 항체를 제작하여, 인산화로 합성된 펩티드를 통해 그 특이성을 확인하였다. 그리고 이 항체를 통해 세포 내에서도 DNA손상이 일어나면 BRG1 의 Ser 721에서 인산화가 되는 것을 확인하였다. BRG1은 방사선을 주고 빠른 시간 내에 인산화가 되고 30~60 분까지 증가하다가 점차적으로 감소되는 경향을 보였다. 또한 증가하는 방사선의 정도에 따라 인산화의 정도도 함께 증가하는 것을 보았다. 이러한 결과는ATP에 의존적인 chromatin remodeler중 하나인BRG1이 DNA 손상에 따른 반응에서 ATM의 새로운 목표물이 되어 기능 할 것이라는 것을 보여 준다. 현재 세포 내에서 이러한 현상이 일어나는 것을 조사하고 있으며, DNA 손상 반응에서BRG1의 인산화가 어떤 영향을 미칠 것인지에 대해서도 연구할 계획이다.;Upon generation of DNA double-strand breaks (DSBs), the signaling pathways become activated and lead to cell cycle arrest and DNA repair in a highly coordinated fashion, which is collectively known as DNA damage response. ATM, belonging to the PI3-like kinase family, plays a central role in these cellular responses by activating a number of checkpoint and repair proteins. Our laboratory has previously shown that BRG1, the catalytic subunit of SWI/SNF chromatin remodeling complex, plays a direct role in DSB repair by stimulating the phosphorylation of variant histone H2AX on the chromatin around the sites of DNA breaks. In this thesis, I show that BRG1 is phosphorylated by ATM in response to DNA damage. First, I found by two-dimensional gel analysis that BRG1 is modified by phosphorylation after exposure to ionizing radiation (IR). To define the residue subject to phosphorylation by ATM, I prepared a series of GST fusion proteins containing subdomains of BRG1 either in the form of wild type or mutants in which several Ser residues in the conserved SQ motifs are changed to Ala. By employing these GST-BRG1 proteins in vitro kinase assays using immuneprecipitated ATM, I identified Ser 721 to be phosphorylated by ATM. Subsequently, I generated the antibodies that specifically recognize the phospho-Ser-721 and verified the specificity of these antibodies using the synthetic phospho-peptides. Using these antibodies, I was able to demonstrate that Ser 721 of BRG1 is phosphorylated by ATM in vitro. Finally, using the phospho-antibodies, I examined whether the phosphorylation of BRG1 at Ser 721 occurs in response to IR within the cells. I found that BRG1 is rapidly phosphorylated at Ser 721 after irradiation, with phosphorylation of BRG1 on Ser 721 levels maximized between 30-60 min post-irradiation and gradually diminished afterwards, and that the levels of BRG1 phosphorylation were proportionally increased as cells were exposed to increased IR dosages. These results suggest that BRG1 functions as a novel ATM targets in response to DNA damage. I am currently further investigating the ATM phosphorylation of BRG1 in vivo and pursuing to elucidate the role of the BRG1 phosphorylation in DNA damage response.