Functional Studies of Small Ubiquitin-Related Modifier, SUMO-1, as a Suppressor for ROS Production

Abstract

Small ubiquitin-related modifier-1 (SUMO-1) is a member of ubiquitin-like protein modifier (Ubls) superfamily, and become covalently attached to various intracellular target proteins as a way to alter their function, cellular localization. Although SUMO is structually related to ubiquitin which involved in protein degragation, its biological function is distinct to ubiquitin. Previously, we found that HEK 293T cells overexpressing SUMO-1 are more protective to the cell death induced by various stresses including heat shock. In addition, SUMOylation is significantly increased in response to heat shock. To explain the effect of SUMO-1 in stress reponse, the production of reactive oxygen species (ROS) induced by external stresses and activation profile of MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase) was investigated. These results suggest that SUMO-1 can block the generation of ROS. Further studies should be done to identify the molecules regulated by SUMO-1 in ROS production in response to stresses. To identify the sumoylated proteins in response to various stresses by sequencing with tandem mass spectrometry, the mutant Q94K of SUMO-1 changing the C-terminal residues was designed to determine the sumoylated target protein and sites. This mutant can conjugate to K residues of target proteins same as wild SUMO-1 and can be cleaved by tryptic digestion to make signature sequence TGG at K in sumoylated site of target proteins that can be detected by amino sequencing with nano LC-ESI-q-TOF tandem MS. Several novel proteins were identified by employing this strategies. These results can provide the valuable information on the regulation mechanism of SUMO-1 in stress responses. Recent reports suggested that SUMO-1 has the antagonistic effect to ubiquitin by competitive conjugation at the same K residues. This study showed an example that SUMO-1 prevented recruitment of poly-ubiquitinated substrates to the UBA domain in the hFAF1 in vivo. The detail regulatory mechanism of SUMO-1 should be further studied.;SUMO-1 (Small ubiquitin-related modifier) 단백질은 101 개 아미노산으로 이루어진 ubiquitin 과 구조가 유사한 단백질 (Ubl proteinfamily) 중의 하나이다. SUMO-1 은 세포안에 있는 표적단백질에 posttranslationalmodification 을 일으킴으로써 표적단백질의 기능, 활성,세포내의 위치 등을 조절하는 중요한 기전으로 알려져 있는데, SUMO-1 의 밝혀진 표적단백질 대부분이 핵내에 존재하고 SUMOylation 의 기능 중 전사조절에서의 역할이 가장 크게 알려져있다.본 연구에서는 크게 세 가지 부분의SUMO-1 에 대한 연구를 진행하였다. 첫번째로, 외부에서 stress 가 주어졌을 경우 SUMO-1 이 세포내에서 어떠한 기능을 수행하는지 알아보았다. 이를 위해 SUMO-1 을 항상 발현하고 있는 stable cell line 을 준비하고 heat shock stress 를 준 후, immunoblotting 을 통해 SUMOylation 의 변화를 살펴보았다. 이 결과, heat shock 을 준 경우 SUMO-1 에 의한 SUMOylation 이 크게 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이런한 현상을 바탕으로 자극에 의한 ROS 의 생성과 SUMO-1 의 기능에 대한 연관성을 연구하기 위하여 SUMO-1 을 항상 발현하고 있는 세포를 준비한 후 heat shock 과 TNFα 로 세포를 자극시킨 후 ROS 생성정도와 MAPK activity profile 을 관찰하였다. 그 결과 SUMO-1 이 항상 발현되는 세포에서는 ROS 의 생성이 유의하게 감소하였고 ROS 에 의해 활성화되는 JNK 와 p38 도 활성이 저해되는 결과를 얻어, ROS 생성을 SUMO-1 가 저해한다는 결론을 얻을 수 있었다. 분자적수준에서 SUMO-1 에 의해 조절되는 특정단백질을 찾기 위해 membrane 을 분리하여 immunoprecipitation 방법을 통해 SUMOylation 되는 단백질을 찾아보았으나 ROS signal 조절에 관련된 단백질을 찾지 못하였다. 그러나 앞으로 SUMO-1 의 핵이외의 세포내에서의 연구는 좀더 연구되어야 할 것이다. 둘째로, SUMOyltion 에 의해 조절되는 표적단백질의SUMOylation site 의 proteomic analysis 를 위해 mutant 제작하였다. 최근 질량분석기를 이용한 연구가 활발해지고 있으나 SUMO-1 의 경우, 표적단백질에 conjugation 된 SUMO-1 peptide 에 tryptic site 인 Lys 이나 Arg 의 부족으로 질량분석기에 의한 연구에 어려움이 있다. 이에 point mutation 된 SUMO-1 Q94K 를 제조하고, 이 단백질이 정상 SUMO-1 과 동일한 sumoylation 활성을 가짐을 immunoblotting 을 통해 확인하였다. SUMO-1 Q94K 를 이용한 proteomic analysis 를 통해 새로운 SUMOylation 표적단백질인 PARP-1 을 밝혀내었다. 마지막으로, 본 실험실에서 연구해온, hFAF1 단백질에 대한 SUMO-1 의 작용에 대하여 연구하였다. 최근 여러논문에서 SUMO-1 이 동일한 표적단백질 Lys 에 ubiquitin 과 경쟁적으로 conjugation 됨으로써 ubiquitination 에 의한 단백질분해과정을 방해한다는 것이 밝혀졌다. hFAF1 단백질의 N-term 에 존재하는 UBA domain 은 polyubiquitination 된 단백질들을 recruit 시키는 것으로 알려져있는데 in vivo 상에서 SUMO-1 이 hFAF1 의 UBA domain 의 역할인 polyubiquitination 단백질을 recruit 하는 작용을 억제함을 확인할 수 있었다.